鄭琰+劉淑華
[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定清熱化毒丸中連翹苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈-水(26∶74)為流動相,檢測波長為277 nm,流速為1.0 ml/min。 結果 連翹苷進樣量在0.2124~5.3100 μg (r=0.9994)線性范圍內,線性關系良好,平均回收率為98.46%,RSD=0.86%(n=6)。 結論 該方法準確、重復性好,可用于清熱化毒丸的質量控制。
[關鍵詞] 清熱化毒丸;連翹苷;高效液相色譜法
[中圖分類號] R286.0[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721(2014)04(c)-0061-02
The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography
ZHENG Yan LIU Shu-hua
Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China
[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.
[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography
清熱化毒丸是由連翹、青黛、黃芩、黃連、菊花、犀角粉等16味藥煉制而成,收載于原衛生部藥品標準·中藥成方制劑第二冊,具有清火化毒,消腫止痛的作用,主要用于小兒身熱煩躁,咽喉腫痛,口舌生瘡,皮膚瘡癤,口臭,便秘等。原標準中只有薄層色譜法進行定性分析,而文獻資料只有對黃連、黃芩之類的質量分析,沒有針對連翹苷的定量分析,藥理實驗表明,連翹苷具有較強的抗病毒、強心、抗肝損傷性等活性,為了有效地控制藥品的內在質量,筆者故建立對連翹苷的高效液相色譜測定法(HPLC)[1-4]。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Waters e2695型高效液相色譜儀;Waters2489紫外檢測器;Waters Empower色譜工作站。BP 211D電子分析天平(德國賽多利斯公司),9860 A型超聲儀(費納米科技發展有限公司)。
1.2 試藥
連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110821-201112);清熱化毒丸(遼寧仙草堂藥業股份有限公司,批號:130901,130301,130501);乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱 Hypersil C18(4.6 mm×250 mm;5μm);流動相:乙腈-水(26∶74);流速:1.0 ml/min;柱溫:28℃;波長:277 nm;理論板數:按連翹苷計算≥3000[5-9]。
2.2 溶液制備
2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取連翹苷對照品適量,加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液,即得。
2.2.2 供試品溶液的制備取清熱化毒丸,剪碎,精稱15.0 g,置錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,密塞,冷浸過夜,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量 搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液的制備取除連翹外的其他藥材,按所確定的工藝生產陰性樣品,按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。
2.3 方法學考察
2.3.1 專屬性實驗取陰性供試品溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μl,依法分別注入液相色譜儀,在連翹苷對照品色譜相應的位置上,供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰,陰性對照品溶液在此處無干擾,表明其他組分對測定無干擾(圖1)。
a.對照品溶液;b.供試品溶液;c.陰性對照溶液;1.連翹苷
圖1 HPLC色譜圖
2.3.2 線性關系考察分別精密吸取對照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色譜儀,依法測定連翹苷的峰面積。以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=39029X+14747,r=0.9994,結果表明,連翹苷對照品進樣量在0.2124~5.3100 μg范圍內線性關系良好。
2.3.3 精密度試驗取供試品(批號130901),精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液。精密吸取10 μl,連續進樣6次,測定色譜峰面積的RSD為0.38%,結果表明,儀器的精密度良好。
2.5.4 重復性試驗取同一批號(130901)樣品6份,分別精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,分別進樣分析,測定連翹苷的含量,結果平均含量為0.1024 mg/g,RSD為1.3%,結果表明,該方法重復性良好。
2.3.5 穩定性試驗取同一供試品溶液,分別于0、2、4、 8、12 h時分別進樣10 μl,分別進樣分析,結果連翹苷峰面積的RSD為0.28%,結果表明,供試品溶液在12 h內基本穩定。
2.3.6 加樣回收率試驗取已知含量的同批樣品(批號130901,連翹苷含量為0.1024 mg/g)6份,每份7.5 g,精密稱定,分別精密加入連翹苷對照品溶液(0.2124 mg/ml)3.5 ml,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,注入液相色譜儀,測定色譜峰面積,計算平均回收率,結果見表1。
表1 回收率試驗測定結果
2.3.7 樣品測定取3批樣品,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,進樣10 μl,采用外標法計算樣品中連翹苷的含量,結果見表2。
表2 樣品中連翹苷的測定結果(n=2)
3 討論
3.1 流動相選擇
流動相選擇時曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)與乙腈-水(26∶74)進行比較實驗,結果還是采用乙腈-水(26∶74)作為流動相,連翹苷能與其他雜質有較好的分離。
3.2 提取方法的考察
《中國藥典》2010年版中采用的提到方法為上柱法,這種方法操作復雜,耗時長,而筆者采用的超聲法操作比較簡單,消耗的時間相對比較少,而這種方法重現好,樣品與雜質也能夠得到好的分離。
3.2 超聲時間的選擇
在20、30、40 min進行測定,結果提示,30 min時連翹苷已基本提取完全,故確定時間為30 min。
綜上所述,本文建立了一種專屬性強、簡單快捷的定量方法,對連翹苷的質量控制有一定的參考作用。
[參考文獻]
[1]國家藥典委員會.中國藥典[M]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010:284.
[2]衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)[Z].274.
[3]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海:上海科技出版社,2006:1552-1555.
[4]肖培根.新編中藥志(第五卷)[M].北京:化學工業出版社,2007:797-802.
[5]史大軍,邱海蘊,康紅英.HPLC法測定清喉咽顆粒中連翹苷的含量[J].中國藥事,2012,26(1):57-58.
[6]孟和,朱艷紅,吳學軍.HPLC法測定保和丸中連翹苷的含量[J].中國藥事,2013,27(3):312-314.
[7]黃螺嘉,楊文紅,鄭劍紅.HPLC法測定小兒感冒退熱糖漿中連翹苷的含量[J].中草藥,2004,35(7):768.
[8]陸紅柳,譚喜瑩,趙陸華,等.連翹中連翹苷HPLC測定方法的改進[J].中草藥,2007,38(6):936-937.
[9]韓桂茹,龐國勛.連翹苷檢測波長的研究[J].中國藥品,2005,6(3):71-73.
(收稿日期:2014-03-19本文編輯:許俊琴)
[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定清熱化毒丸中連翹苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈-水(26∶74)為流動相,檢測波長為277 nm,流速為1.0 ml/min。 結果 連翹苷進樣量在0.2124~5.3100 μg (r=0.9994)線性范圍內,線性關系良好,平均回收率為98.46%,RSD=0.86%(n=6)。 結論 該方法準確、重復性好,可用于清熱化毒丸的質量控制。
[關鍵詞] 清熱化毒丸;連翹苷;高效液相色譜法
[中圖分類號] R286.0[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721(2014)04(c)-0061-02
The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography
ZHENG Yan LIU Shu-hua
Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China
[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.
[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography
清熱化毒丸是由連翹、青黛、黃芩、黃連、菊花、犀角粉等16味藥煉制而成,收載于原衛生部藥品標準·中藥成方制劑第二冊,具有清火化毒,消腫止痛的作用,主要用于小兒身熱煩躁,咽喉腫痛,口舌生瘡,皮膚瘡癤,口臭,便秘等。原標準中只有薄層色譜法進行定性分析,而文獻資料只有對黃連、黃芩之類的質量分析,沒有針對連翹苷的定量分析,藥理實驗表明,連翹苷具有較強的抗病毒、強心、抗肝損傷性等活性,為了有效地控制藥品的內在質量,筆者故建立對連翹苷的高效液相色譜測定法(HPLC)[1-4]。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Waters e2695型高效液相色譜儀;Waters2489紫外檢測器;Waters Empower色譜工作站。BP 211D電子分析天平(德國賽多利斯公司),9860 A型超聲儀(費納米科技發展有限公司)。
1.2 試藥
連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110821-201112);清熱化毒丸(遼寧仙草堂藥業股份有限公司,批號:130901,130301,130501);乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱 Hypersil C18(4.6 mm×250 mm;5μm);流動相:乙腈-水(26∶74);流速:1.0 ml/min;柱溫:28℃;波長:277 nm;理論板數:按連翹苷計算≥3000[5-9]。
2.2 溶液制備
2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取連翹苷對照品適量,加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液,即得。
2.2.2 供試品溶液的制備取清熱化毒丸,剪碎,精稱15.0 g,置錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,密塞,冷浸過夜,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量 搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液的制備取除連翹外的其他藥材,按所確定的工藝生產陰性樣品,按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。
2.3 方法學考察
2.3.1 專屬性實驗取陰性供試品溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μl,依法分別注入液相色譜儀,在連翹苷對照品色譜相應的位置上,供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰,陰性對照品溶液在此處無干擾,表明其他組分對測定無干擾(圖1)。
a.對照品溶液;b.供試品溶液;c.陰性對照溶液;1.連翹苷
圖1 HPLC色譜圖
2.3.2 線性關系考察分別精密吸取對照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色譜儀,依法測定連翹苷的峰面積。以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=39029X+14747,r=0.9994,結果表明,連翹苷對照品進樣量在0.2124~5.3100 μg范圍內線性關系良好。
2.3.3 精密度試驗取供試品(批號130901),精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液。精密吸取10 μl,連續進樣6次,測定色譜峰面積的RSD為0.38%,結果表明,儀器的精密度良好。
2.5.4 重復性試驗取同一批號(130901)樣品6份,分別精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,分別進樣分析,測定連翹苷的含量,結果平均含量為0.1024 mg/g,RSD為1.3%,結果表明,該方法重復性良好。
2.3.5 穩定性試驗取同一供試品溶液,分別于0、2、4、 8、12 h時分別進樣10 μl,分別進樣分析,結果連翹苷峰面積的RSD為0.28%,結果表明,供試品溶液在12 h內基本穩定。
2.3.6 加樣回收率試驗取已知含量的同批樣品(批號130901,連翹苷含量為0.1024 mg/g)6份,每份7.5 g,精密稱定,分別精密加入連翹苷對照品溶液(0.2124 mg/ml)3.5 ml,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,注入液相色譜儀,測定色譜峰面積,計算平均回收率,結果見表1。
表1 回收率試驗測定結果
2.3.7 樣品測定取3批樣品,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,進樣10 μl,采用外標法計算樣品中連翹苷的含量,結果見表2。
表2 樣品中連翹苷的測定結果(n=2)
3 討論
3.1 流動相選擇
流動相選擇時曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)與乙腈-水(26∶74)進行比較實驗,結果還是采用乙腈-水(26∶74)作為流動相,連翹苷能與其他雜質有較好的分離。
3.2 提取方法的考察
《中國藥典》2010年版中采用的提到方法為上柱法,這種方法操作復雜,耗時長,而筆者采用的超聲法操作比較簡單,消耗的時間相對比較少,而這種方法重現好,樣品與雜質也能夠得到好的分離。
3.2 超聲時間的選擇
在20、30、40 min進行測定,結果提示,30 min時連翹苷已基本提取完全,故確定時間為30 min。
綜上所述,本文建立了一種專屬性強、簡單快捷的定量方法,對連翹苷的質量控制有一定的參考作用。
[參考文獻]
[1]國家藥典委員會.中國藥典[M]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010:284.
[2]衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)[Z].274.
[3]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海:上海科技出版社,2006:1552-1555.
[4]肖培根.新編中藥志(第五卷)[M].北京:化學工業出版社,2007:797-802.
[5]史大軍,邱海蘊,康紅英.HPLC法測定清喉咽顆粒中連翹苷的含量[J].中國藥事,2012,26(1):57-58.
[6]孟和,朱艷紅,吳學軍.HPLC法測定保和丸中連翹苷的含量[J].中國藥事,2013,27(3):312-314.
[7]黃螺嘉,楊文紅,鄭劍紅.HPLC法測定小兒感冒退熱糖漿中連翹苷的含量[J].中草藥,2004,35(7):768.
[8]陸紅柳,譚喜瑩,趙陸華,等.連翹中連翹苷HPLC測定方法的改進[J].中草藥,2007,38(6):936-937.
[9]韓桂茹,龐國勛.連翹苷檢測波長的研究[J].中國藥品,2005,6(3):71-73.
(收稿日期:2014-03-19本文編輯:許俊琴)
[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定清熱化毒丸中連翹苷含量的方法。 方法 采用Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈-水(26∶74)為流動相,檢測波長為277 nm,流速為1.0 ml/min。 結果 連翹苷進樣量在0.2124~5.3100 μg (r=0.9994)線性范圍內,線性關系良好,平均回收率為98.46%,RSD=0.86%(n=6)。 結論 該方法準確、重復性好,可用于清熱化毒丸的質量控制。
[關鍵詞] 清熱化毒丸;連翹苷;高效液相色譜法
[中圖分類號] R286.0[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721(2014)04(c)-0061-02
The content of phillyrin of Qingre huadu wan determined by high performance liquid chromatography
ZHENG Yan LIU Shu-hua
Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang 122000,China
[Abstract] Objective To establish the method of high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of phillyrin of Qingre huadu wan. Methods Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) chromatographic column was used.The mobile phase cinsisted of acetonitrile-water (26∶74),the detection wavelength was 277 nm and the flow rate of 1.0 ml/min. Results Phillyrin sample volume showed good linear relationship in the range of 0.2124-5.3100 μg (r=0.9994);the average recovery rate was 98.46%,RSD=0.86% (n=6). Conclusion The method is accurate with a good reproducibility,and suitable for quality control of Qingre huadu wan.
[Key words] Qingre huadu wan;Phillyrin;High performance liquid chromatography
清熱化毒丸是由連翹、青黛、黃芩、黃連、菊花、犀角粉等16味藥煉制而成,收載于原衛生部藥品標準·中藥成方制劑第二冊,具有清火化毒,消腫止痛的作用,主要用于小兒身熱煩躁,咽喉腫痛,口舌生瘡,皮膚瘡癤,口臭,便秘等。原標準中只有薄層色譜法進行定性分析,而文獻資料只有對黃連、黃芩之類的質量分析,沒有針對連翹苷的定量分析,藥理實驗表明,連翹苷具有較強的抗病毒、強心、抗肝損傷性等活性,為了有效地控制藥品的內在質量,筆者故建立對連翹苷的高效液相色譜測定法(HPLC)[1-4]。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Waters e2695型高效液相色譜儀;Waters2489紫外檢測器;Waters Empower色譜工作站。BP 211D電子分析天平(德國賽多利斯公司),9860 A型超聲儀(費納米科技發展有限公司)。
1.2 試藥
連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110821-201112);清熱化毒丸(遼寧仙草堂藥業股份有限公司,批號:130901,130301,130501);乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱 Hypersil C18(4.6 mm×250 mm;5μm);流動相:乙腈-水(26∶74);流速:1.0 ml/min;柱溫:28℃;波長:277 nm;理論板數:按連翹苷計算≥3000[5-9]。
2.2 溶液制備
2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取連翹苷對照品適量,加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液,即得。
2.2.2 供試品溶液的制備取清熱化毒丸,剪碎,精稱15.0 g,置錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,密塞,冷浸過夜,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量 搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液的制備取除連翹外的其他藥材,按所確定的工藝生產陰性樣品,按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。
2.3 方法學考察
2.3.1 專屬性實驗取陰性供試品溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μl,依法分別注入液相色譜儀,在連翹苷對照品色譜相應的位置上,供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰,陰性對照品溶液在此處無干擾,表明其他組分對測定無干擾(圖1)。
a.對照品溶液;b.供試品溶液;c.陰性對照溶液;1.連翹苷
圖1 HPLC色譜圖
2.3.2 線性關系考察分別精密吸取對照品溶液1、5、 10、15、20、25 μl注入液相色譜儀,依法測定連翹苷的峰面積。以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=39029X+14747,r=0.9994,結果表明,連翹苷對照品進樣量在0.2124~5.3100 μg范圍內線性關系良好。
2.3.3 精密度試驗取供試品(批號130901),精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液。精密吸取10 μl,連續進樣6次,測定色譜峰面積的RSD為0.38%,結果表明,儀器的精密度良好。
2.5.4 重復性試驗取同一批號(130901)樣品6份,分別精密稱取15.0 g,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,分別進樣分析,測定連翹苷的含量,結果平均含量為0.1024 mg/g,RSD為1.3%,結果表明,該方法重復性良好。
2.3.5 穩定性試驗取同一供試品溶液,分別于0、2、4、 8、12 h時分別進樣10 μl,分別進樣分析,結果連翹苷峰面積的RSD為0.28%,結果表明,供試品溶液在12 h內基本穩定。
2.3.6 加樣回收率試驗取已知含量的同批樣品(批號130901,連翹苷含量為0.1024 mg/g)6份,每份7.5 g,精密稱定,分別精密加入連翹苷對照品溶液(0.2124 mg/ml)3.5 ml,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,精密吸取10 μl,注入液相色譜儀,測定色譜峰面積,計算平均回收率,結果見表1。
表1 回收率試驗測定結果
2.3.7 樣品測定取3批樣品,按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,進樣10 μl,采用外標法計算樣品中連翹苷的含量,結果見表2。
表2 樣品中連翹苷的測定結果(n=2)
3 討論
3.1 流動相選擇
流動相選擇時曾采用乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)與乙腈-水(26∶74)進行比較實驗,結果還是采用乙腈-水(26∶74)作為流動相,連翹苷能與其他雜質有較好的分離。
3.2 提取方法的考察
《中國藥典》2010年版中采用的提到方法為上柱法,這種方法操作復雜,耗時長,而筆者采用的超聲法操作比較簡單,消耗的時間相對比較少,而這種方法重現好,樣品與雜質也能夠得到好的分離。
3.2 超聲時間的選擇
在20、30、40 min進行測定,結果提示,30 min時連翹苷已基本提取完全,故確定時間為30 min。
綜上所述,本文建立了一種專屬性強、簡單快捷的定量方法,對連翹苷的質量控制有一定的參考作用。
[參考文獻]
[1]國家藥典委員會.中國藥典[M]. 北京:中國醫藥科技出版社,2010:284.
[2]衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)[Z].274.
[3]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海:上海科技出版社,2006:1552-1555.
[4]肖培根.新編中藥志(第五卷)[M].北京:化學工業出版社,2007:797-802.
[5]史大軍,邱海蘊,康紅英.HPLC法測定清喉咽顆粒中連翹苷的含量[J].中國藥事,2012,26(1):57-58.
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(收稿日期:2014-03-19本文編輯:許俊琴)