姜黃素納米粒（NanoCurcTM）聯合索拉非尼對肝細胞癌（HCC）的協同抑制作用

胡 博 孫 超 孫 鼎 孫云帆 徐 泱

（復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所 上海 200032）

姜黃素納米粒（NanoCurcTM）聯合索拉非尼對肝細胞癌（HCC）的協同抑制作用

胡 博 孫 超 孫 鼎 孫云帆 徐 泱△

（復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所 上海 200032）

目的探討姜黃素納米粒（NanoCurcTM，NC）單藥或聯合索拉非尼對人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的作用。方法采用體外細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）、體外劃痕試驗和Transwell侵襲試驗法檢測NC和/或索拉非尼對肝癌細胞株MHCCLM3增殖、遷移、侵襲能力的影響；應用流式細胞術分析其對細胞凋亡的作用。建立裸鼠MHCCLM3原位移植模型并觀察NC和/或索拉非尼對腫瘤大小和肺轉移率的影響。應用RTPCR、ELISA、Western blot法檢測基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）mRNA或相應蛋白表達變化；并測定ERK1/2的磷酸化變化。結果NC與索拉非尼聯合應用可顯著抑制HCC體外增殖和侵襲能力（P＜0.01），抑制體內腫瘤生長和肺轉移（P＜0.01）。單獨應用NC和索拉非尼時肺轉移率分別為50.0%和66.7%，兩者聯合用藥時則顯著降低至16.7%。兩藥聯合應用可協同抑制ERK磷酸化，從而下調MMP-9的表達。結論NC聯合索拉非尼可通過協同誘導細胞凋亡、抑制MMP-9的表達而抑制肝癌生長和轉移。

肝細胞癌（HCC）； 姜黃素納米粒（NC）； 索拉非尼； 基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）

姜黃素是提取自姜科姜黃屬植物姜黃根莖的一種酚化合物，具有抗炎、抗風濕和治療肝、膽疾病等作用[1]。然而，姜黃素親水性及親脂性差，生物利用率低，極大限制了其臨床應用[2]。相關研究證明姜黃素納米粒（NanoCurcTM，NC）可顯著提高姜黃素溶解度和生物利用率，減少用藥劑量，并抑制肝腫瘤生長[3-4]。索拉非尼被美國FDA批準用于治療不能手術切除和遠處轉移肝癌的靶向藥物，但其價格昂貴、不良反應大，并且仍有約50%的晚期肝癌對其不敏感[5]。通過與其他藥物聯合應用，可降低索拉非尼的劑量，減少不良反應，增強藥物療效。而NC與索拉非尼聯用尚未見報道。本研究旨在觀察NC單藥或聯合索拉非尼對人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的抗腫瘤作用，并探討其作用機制。

材料和方法

藥物姜黃素納米粒（NanoCurcTM）由美國霍普金斯大學提供。索拉非尼購自德國拜耳公司，溶解于100%DMSO保存，體外實驗中DMSO終濃度小于0.1%。

細胞培養肝癌細胞株MHCCLM3由復旦大學肝癌研究所建立，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基（美國Gibco公司），在37℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養。

細胞增殖實驗將消化好的細胞按照3 000/孔接種于96孔板，培養過夜。待細胞貼壁后加藥處理。分別予不同濃度NC（10、20、40、60、80μmol/L）作用于肝癌MHCCLM3細胞。培養不同時間后（24，48，72 h）每孔加入CCK8（杭州碧云天公司），孵育2 h。570 nm酶標儀（Model 680，美國Bio-Rad公司）測吸光度（D）值。分對照（DMSO）組、NC（40μmol/L）組、索拉非尼（10μmol/L）組及NC（40μmol/L）+索拉非尼組（10μmol/L），加藥后培養48 h，按照上述方法檢測。實驗重復3次。

細胞凋亡實驗按照試劑盒說明書操作，將MHCCLM3細胞以2×105/孔接種于6孔板中培養過夜，按上述方法分4組。經48 h處理后胰酶消化收集細胞，經400×g離心5 min并用Annexin-VFITC/PI試劑盒（美國BD公司）染色。避光孵育15 min，流式細胞術檢測。實驗重復3次。

細胞劃痕實驗細胞以1×105/孔接種于6孔板，常規培養；待細胞80%～90%融合時，棄去培養基，PBS漂洗1次，用滅菌的1μL Tip頭在皿底劃一直線，PBS漂洗2次。按上述分組方法處理細胞，并分別在0、24、48 h于倒置顯微鏡下拍攝。

細胞侵襲實驗MHCCLM3細胞用Matrigel（美國BD公司）按1∶7稀釋后，取75μL包被Transwell上室，置于37℃ 下4 h。細胞用胰酶消化、400×g離心5 min，加DMEM培養基制成含2×104個單細胞懸液500μL，加入Transwell上室中，并按上述分組方法加入存物。下室中加入含10%血清培養液。放入37℃培養箱常規培養24 h后固定，Giemsa染色，于倒置顯微鏡下隨機選取3個視野計數染色細胞。實驗重復3次。侵襲率（%）=用藥孔穿膜細胞數/對照孔穿膜細胞數×100%。

人肝癌裸鼠原位模型及分組采用人肝癌細胞株MHCCLM3建立裸鼠原位肝癌模型[6]，將小鼠（上海斯萊克公司）隨機分為NC組（NC每日1.56 g/kg）、索拉非尼組（索拉非尼每日30 mg/kg）、聯合用藥組（每日NC 1.56 g/kg+索拉非尼30 mg/kg）和對照組（PBS），每組6只。裸鼠于腫瘤接種后第7天開始用藥，治療持續4周。于種植后第5周末處死，切除肝臟腫瘤及肺臟，以10%甲醛固定。（1）計算腫瘤體積，V=AB2/2（A、B分別為腫瘤的最大和最小直徑）。（2）連續切取30張肺組織切片做組織學檢查，顯微鏡下觀察，計算肺轉移灶數目及肺轉移率。

實時定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）細胞或組織抽提總RNA，按逆轉錄以及擴增試劑盒（日本Takara公司）說明書要求進行反應。MMP-9上 游 引 物：5＇-GCCAACTACGACACCGACGAC-3＇；下 游 引 物：5＇-TTGGCCTTGGAAGATGAATGGA-3＇。GAPDH 上游引物：5＇-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3＇；下 游 引 物：5＇-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。ΔCt=目的基因ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=用藥組ΔCt的均數-對照組ΔCt的均數。實驗重復3次。

酶聯免疫吸附法（ELISA）1×105/孔細胞接種于6孔板上，常規培養，待細胞80%～90%融合時，按照上述分組處理。48 h后收集上清液，采用ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司）檢測MMP-9蛋白含量，實驗步驟按照說明書進行。實驗重復3次。

蛋白質印跡法（Western hlot）采用考馬斯亮藍法（Bradford法）檢測標本組織抽提液中總蛋白的濃度，操作步驟參照說明書。NF-κB（p65）（#3034），p44/42 MAPK （Erk1/2）（#9102），TIMP1（D10E6）Rabbit mAb（#8946）購自美國CST公司；Anti-ERK1/ERK2抗體（#ab17942），MMP-9（#AB911）購自美國Abcam公司；Actin抗體（H-196）（#sc-7210），兔IgG-HRP（#sc-2749），鼠IgG-HRP（#sc-2748）購自美國Santa Cruz公司；RapidStepTMECL Reagent Millipore試劑（#345818）購自德國Millipore公司。

統計分析應用SPSS 19.0軟件統計數據，計量資料用±s表示。組間比較用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

NC單藥或聯合索拉非尼對MHCCLM3細胞增殖能力的影響MHCCLM3細胞與NC有著劑量-時間依賴的關系，細胞存活率會隨著劑量的增加及作用時間的延長而明顯降低。作用24、48、72 h后NC的IC50值分別是40、35、33μmol/L （圖1A）。聯合用藥組細胞存活率最低，但與NC（P=0.910）或索拉非尼（P=0.415）單藥組相比，差異無統計學意義（圖1B）。

圖1 NC單藥或聯合索拉非尼抑制MHCCLM3細胞增殖能力和侵襲能力（×200）Fig 1 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited MHCCLM3 cell proliferation and invasion（×200）A and B：Viability of MHCCLM3；C and D：MHCCLM3 transwell figure and data.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.05；（3）vs.So，P＜0.05.

NC單藥或聯合索拉非尼對MHCCLM3細胞遷移和侵襲能力的影響體外劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，用藥組均使細胞遷移能力明顯減弱。當聯合用藥時，細胞遷移能力弱于單藥組。Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，NC單獨應用對侵襲有明顯的抑制作用（P＜0.01），與索拉非尼單藥相似（P＜0.01）；但聯合用藥組對細胞侵襲抑制作用強于單用NC或索拉非尼組（P＜0.05，圖1C、D）。

NC單藥或聯合索拉非尼對MHCCLM3細胞凋亡的影響流式細胞術檢測凋亡的結果見圖2A。3個用藥組與對照組相比，細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。對照組的 MHCCLM3細胞凋亡率為9.36%±0.12%，NC單藥組為17.40%±0.18%，索拉非尼單藥組為15.39%±0.14%，兩藥聯合組為22.85%±0.25%。聯合組與NC單藥組或索拉非尼單藥組相比，差異均有統計學意義（P＜0.01），提示兩藥聯合應用具有明顯的協同作用（圖2B）。

圖2 NC單藥或聯合索拉非尼誘導MHCCLM3細胞凋亡Fig 2 NC alone and in comhination with sorafenih induced MHCCLM3 cell apoptosisA：Flow cytometry of MHCCLM3；B：Apoptosis results of MHCCLM3.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.01；（3）vs.So，P＜0.01.

NC單藥或聯合索拉非尼對裸鼠腫瘤的抑制作用NC組腫瘤大小為（0.75±0.14）cm3（P＜0.05），索拉非尼組為（0.50±0.11）cm3（P＜0.01），聯合組為（0.45±0.09）cm3（P＜0.01），均顯著低于對照組（1.26±0.13）cm3（圖3）；NC或索拉非尼單藥組肺轉移率分別為50.0%和66.7%，對腫瘤肺轉移抑制作用差異無統計學意義（P=0.182，P=0.455）。聯合用藥在未明顯增加藥物不良反應的基礎上，肺轉移率為16.7%，對肺轉移具有顯著的抑制作用（P=0.015，表1）。

圖3 NC單藥或聯合索拉非尼抑制體內腫瘤生長及肺轉移率Fig 3 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited tumor volume and incidence of lung metastasisvs.Control，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01；（3）vs.NC，P＜0.05.

表1 裸鼠肝癌原位移植模型結果Tah 1 Summary of orthotopic xenograft liver tumor moddel in nude mice

NC單藥或聯合索拉非尼對肝細胞癌MMP-9和p-ERK表達的影響ELISA和Western blot結果顯示，在肝癌細胞及小鼠肝癌組織中，MMP-9和p-ERK在對照組中的表達量最高，其在NC單藥和索拉非尼單藥組的表達水平較對照組明顯下調，聯合用藥組的表達量最低；而MMP-9抑制劑TIMP-1的表達則正好相反，在對照組中的表達量最低，在兩藥聯合組中表達量最高（圖4B、D、E）。各組ERK未見明顯變化。在m RNA水平，實驗結果與上述結果一致，在用藥組與對照組及聯合用藥組與單藥組間，MMP-9 mRNA表達水平差異均具有統計學意義（P＜0.01，圖4A）；然而，在體內試驗中，聯合用藥組與單藥組差異無統計學意義（圖4C）。

圖4 NC單藥或聯合索拉非尼抑制MMP-9和p-ERK在體內、外的表達Fig 4 NC alone and in comhination with sorafenih decreased MMP-9 and p-ERK expressionin vitroandin vivoA：MMP-9 mRNA of MHCCLM3in vitro；B：MMP-9 ELISA resultsin vitro；C：MMP-9 mRNA in liver tumor model；D：MMP-9 ELISA results in tumor model；E：Western blot resultsin vitroandin vivo.A：（1）vs.Control，（2）vs.NC，（3）vs.So，P＜0.05；B and D：（1）vs.Control，P＜0.05，（2）vs.Control，P＜0.01，（3）vs.NC+So，P＜0.01，（4）vs.NC，P＜0.05；C：（1）vs.Control，P＜0.05.

討 論

近幾年，腫瘤治療雖然取得長足進步，諸如手術、介入及肝移植等方法的采用，但肝癌總體5年生存率仍僅為15%[7-8]?；瘜W治療因其自身優點受到越來越多的重視，因此對抗腫瘤效果好且不良反應小的藥物的需求不斷增加。目前，研究人員將注意力集中在天然藥物上。天然產物已經成為抗癌藥物的重要來源，約70%抗癌藥物提取自天然產物[9]。

NC克服了姜黃素水溶性差的缺點，增強了其治療效果，并可改善四氯化碳引起的肝損傷和肝硬化[10]。本研究結果顯示，小劑量NC能夠顯著抑制MHCCLM3細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這一結果與高劑量姜黃素對肝癌細胞HEP3B，SK-Hep-1和SNU449抑制能力相似[11]。此外，有研究發現，姜黃素與阿霉素聯合應用可產生協同抗腫瘤作用，我們推測NC可與其他經典肝癌治療藥物聯合應用。因此，本研究選擇索拉非尼與NC聯合應用。結果顯示，相比單藥，NC與索拉非尼聯合應用能更好地抑制MHCCLM3細胞的體外侵襲能力。在裸鼠原位肝癌模型中，我們發現聯合用藥可協同抑制腫瘤生長。由于肝癌肺轉移占肝外轉移的50%以上，我們重點檢測聯合用藥對肝癌肺轉移的作用[12-13]。結果顯示，肺轉移率顯著降至16.7%。

為探討兩種藥物協同抗肝細胞癌的作用機制，本研究采用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示NC和索拉非尼聯合使用時，細胞凋亡比單獨使用NC或索拉非尼時更顯著。腫瘤細胞分泌的MMP-9是最為主要的基質金屬蛋白酶，可降解細胞外基質成分，促進腫瘤的轉移[14-15]。體內、體外試驗結果表明，聯合用藥可通過下調ERK1/2磷酸化水平，下調MMP-9表達，最終達到協同增強抗腫瘤效果的作用。此外，聯合用藥克服了單一藥物治療療效不足的缺點。近期，Liang等[16]報道EF24（與姜黃素分子結果類似）可逆轉索拉非尼耐藥。這一發現提示，NC與索拉非尼聯合應用可有效治療肝細胞癌，具有良好的臨床應用前景。

[1] Singh S.From exotic spice to modern drug？ [J].Cell，2007，130（5）：765-768.

[2] Sharma RA，Mc Lelland HR，Hill KA，et al.Pharmacodynamic and pharmacokinetic study of oral curcuma extract in patients with colorectal cancer[J].Clin Cancer Res，2001，7（7）：1894-1900.

[3] Bisht S，Feldmann G，Soni S，et al.Polymeric nanoparticleencapsulated curcumin（“nanocurcumin”）：a novel strategy for human cancer therapy[J].J Nanobiotechnology，2007，5：3.

[4] Ghosh D，Choudhury ST，Ghosh S，et al.Nanocapsulated curcumin：oral chemopreventive formulation against diethylnitrosamine induced hepatocellular carcinoma in rat[J].Chem Biol Interact，2012，195（3）：206-214.

[5] Cheng AL，Kang YK，Chen Z，et al.Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma：a phase Ⅲrandomised，double-blind，placebo-controlled trial[J].Lancet Oncol，2009，10（1）：25-34.

[6] 李濤，薛瓊，周健煒，等.綠膿桿菌制劑抑制肝細胞肝癌生長轉移的實驗研究[J].中華肝膽外科雜志，2009，15（11）：848-850.

[7] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

[8] Rahbari NN， Mehrabi A， Mollberg NM，et al.Hepatocellular carcinoma：current management and perspectives for the future[J].Ann Surg，2011，253（3）：453-469.

[9] Newman DJ，Cragg GM，Holbeck S，et al.Natural products and derivatives as leads to cell cycle pathway targets in cancer chemotherapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2002，2（4），279-308.

[10] Bisht S，Khan MA，Bekhit M，et al.A polymeric nanoparticle formulation of curcumin （NanoCurcTM）ameliorates CCl4-induced hepatic injury and fibrosis through reduction of pro-inflammatory cytokines and stellate cell activation[J].Lab Invest，2011，91（9）：1383-1395.

[11] Ning L，Wentworth L，Chen H，et al.Down-regulation of Notch1 signaling inhibits tumor growth in human hepatocellular carcinoma[J].Am J Transl Res，2009，1（4）：358-366.

[12] Ikai I，Itai Y，Okita K，et al.Report of the 15th follow-up survey of primary liver cancer[J].Hepatol Res，2004，28（1）：21-29.

[13] Natsuizaka M，Omura T，Akaike T，et al.Clinical features of hepatocellular carcinoma with extrahepatic metastases[J].J Gastroenterol Hepatol，2005，20（11）：1781-1787.

[14] Littlepage LE，Sternlicht MD，Rougier N，et al.Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcino-genesis，metastasis，and angiogenesis progression[J].Cancer Res，2010，70（6）：2224-2234.

[15] Yang P，Yuan W，He J，et al.Overexpression of Eph A2，MMP-9，and MVD-CD34 in hepatocellular carcinoma：Implications for tumor progression and prognosis[J].Hepatol Res，2009，39（12）：1169-1177.

[16] Liang Y，Zheng T，Song R，et al.Hypoxia-mediated sorafenib resistance can be overcome by EF24 through Von Hippel-Lindau tumor suppressor-dependent HIF-1α inhibition in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2013，57（5）：1847-1857.

Synergistic antitumor effects of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM）comhined with sorafenih in human hepatocellular carcinoma（HCC）

HU Bo，SUN Chao，SUN Ding，SUN Yun-fan，XU Yang△
（Liver Cancer Institute，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032，China）

hepatocellular carcinoma （HCC）； NanoCurcTM（NC）； sorafenib； matrix metalloproteinase-9（MMP-9）

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.001

2013-12-12；編輯：張秀峰）

國家科技重大專項（2013ZX10002011-004）；國家自然科學基金（81372317，81071661）；上海浦江人才計劃（13PJD007）

△Corresponding author E-mail：drxuyang@gmail.com

【Ahstract】 OhJectiveTo investigate the effect of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM，NC）alone and in combination with sorafenib usingin vitroandin vivomodels of human hepatocellular carcinoma（HCC）.MethodsThe activity of NCalone and in combination with sorafenib on HCC cell lines（MHCCLM3）was determined by CCK8，wound-healing and modified Boyden chamber assays.Apoptosis of cells was detected by flow cytometry.Primary HCC tumor growth and metastasis were examinedin vivousing orthotopic HCC xenografts in nude mice.RT-PCR，Western blot and ELISA were used to determine the expressions of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9），tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1），extracellular sinal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and phosphorylated ERK 1/2（p-ERK1/2）.ResultsNC combined with sorafenib significantly inhibited the proliferation and invasion of MHCCLM3 cellsin vitro（P＜0.01），also drastically suppressed primary tumor growth and lung metastasesin vivo（P＜0.01）.Lung metastatic rate was 50.0%and 66.7%when NC and sorafenib wasused alone separately，and descended to 16.7%when NC and sorafenib were combined.NC combined with sorafenib could synergistically down-regulate the expression of MMP-9 via inhibiting p-ERK1/2 expression.ConclusionsCombination of NC and sorafenib showed synergistic inhibition effects on tumor growth and metastases by inducing cell apoptosis and inhibiting the expression of MMP-9.

*This work was supported hy the National Key Sci-Tech ProJect（2013ZX10002011-004），National Natural Science Foundation of China（81372317 and 81071661），and PuJiang Scholars Fund of Shanghai（13PJD007）.