檸檬遺傳轉化體系的建立及優(yōu)化

仝鑄+何利剛+吳黎明+王志靜+蔣迎春+孫中海+

摘要：以ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ為載體，對農桿菌ＥＨＡ１０５介導的檸檬［Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ （Ｌ．）Ｂｕｒｍ．ｆ．］遺傳轉化體系進行了優(yōu)化。結果表明，培養(yǎng)基中植物激素的濃度、農桿菌浸染濃度以及浸染后共培養(yǎng)的時間對檸檬的再生和遺傳轉化效率均有明顯影響。１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．１ ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ有利于檸檬上胚軸不定芽的再生，并且再生芽的質量最佳。農桿菌的浸染濃度以ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６為最佳，浸染后共培養(yǎng)２ ｄ，在含５．０ ｍｇ／Ｌ潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，有利于檸檬不定芽再生率的提高。

關鍵詞：檸檬［Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ （Ｌ．） Ｂｕｒｍ．ｆ．］；上胚軸；再生；遺傳轉化體系；優(yōu)化

中圖分類號：Ｓ６６６．５；Ｑ８１３．１＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2100-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ

Ｌｅｍｏｎ［Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ （Ｌ．）Ｂｕｒｍ．ｆ．］

ＴＯＮＧ Ｚｈｕ， ＨＥ Ｌｉ－ｇａｎｇ， ＷＵ Ｌｉ－ｍｉｎｇ， ＷＡＮＧ Ｚｈｉ－ｊｉｎｇ， ＪＩＮＧ Ｙｉｎｇ－ｃｈｕｎ， ＳＵＮ Ｚｈｏｎｇ－ｈａｉ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ ａｎｄ Ｔｅａ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３０064， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ ａｓ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｌｅｍｏｎ ［Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ（Ｌ．） Ｂｕｒｍ．ｆ．］with Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＥＨＡ１０５ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ had ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｅｍｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｗａｓ ｍｏｓｔ ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ to ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｌｅｍｏｎ ｅｐｉｃｏｔｙｌ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ １．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ａｎｄ ０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｉｎ ＭＴ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ０．６（ＯＤ６００ ｎｍ） ａｎｄ ｔｗｏ ｄａｙｓ． Ｆｏｒ ｔｈｅ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｍｏｎ， ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｂｅｎｉｆｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｗａｓ ５．０ ｍｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅｍｏｎ［Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ （Ｌ．）Ｂｕｒｍ．ｆ．］； ｅｐｉｃｏｔｙｌ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

柑橘類水果是世界第一大水果，也是湖北省第一大水果。包括檸檬在內的柑橘類多年生果樹由于多胚性等特點，很難通過傳統(tǒng)的育種途徑培育含有目標性狀且品質優(yōu)良的后代［１］。生物技術特別是基因工程的發(fā)展為柑橘類水果遺傳改良開辟了一條新途徑［２］。柑橘轉基因研究已開展近２０年，盡管在大多數柑橘類植物中如甜橙、金柑、枳、葡萄柚已獲得成功［３－５］，但是柑橘類水果的不同屬間遺傳特性差異較大，即使是同屬的不同類型之間，其再生的難易和對農桿菌的反應也不盡相同［６］。提高柑橘類轉化效率的研究主要集中在影響外植體再生、共培養(yǎng)條件、不定芽的篩選條件等因素上。黃家權等［７］曾對尤力克檸檬的不定芽的發(fā)生因素進行了初步研究。因此，在進行基因功能驗證前，有必要對其目標植物的再生和遺傳轉化體系進行相應的優(yōu)化。檸檬是柑橘類植物中最不抗寒的品種，本研究以ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ為載體，對農桿菌ＥＨＡ１０５介導的檸檬遺傳轉化體系進行了優(yōu)化，建立其高效遺傳轉化體系，以期為抗寒基因在柑橘類植物中的功能驗證和分析提供一個良好的試驗平臺。

１材料與方法

１．１材料和試劑

試驗所用檸檬種子為尤力克檸檬種子，購自武漢市果品批發(fā)市場，產地四川。農桿菌菌株為ＥＨＡ１０５，遺傳轉化載體為ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ（攜帶潮霉素抗性篩選標記），表達基因為ＧＵＳ（β－葡萄糖苷酸酶）。ＧＵＳ基因置于ＣａＭＶ３５Ｓ啟動子下，Ｈｙｇ基因位于ＮＯＳ啟動子下。６－ＢＡ、ＮＡＡ、頭孢霉素（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ，Ｃｅｆ）和利福平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）購自北京鼎國生物公司，潮霉素Ｂ購自美國ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ公司。

１．２培養(yǎng)基的配制

細菌培養(yǎng)基為ＹＥＢ培養(yǎng)基，主要配方如下：

ＹＥＢ培養(yǎng)基：５ ｇ／Ｌ 胰蛋白胨＋１ ｇ／Ｌ 酵母提取物＋５ ｇ／Ｌ牛肉浸膏＋０．４９３ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（瓊脂粉１５ ｇ／Ｌ），ｐＨ 為７．０。

植物組織培養(yǎng)所用的４種培養(yǎng)基配方：ＭＴ基本培養(yǎng)基［８］（ｐＨ ５．８）；ＭＴ懸浮培養(yǎng)基為ＭＴ＋０．５ ｇ／Ｌ麥芽提取物＋１．５ ｇ／Ｌ 谷氨酰胺＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ（乙酰丁香酮）（ｐＨ ５．７）；共培養(yǎng)培養(yǎng)基ＣＭ為ＭＴ＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ（ｐＨ ５．７）；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基ＲＭ為１／２ＭＴ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ（吲哚丁酸）＋０．５ ｇ／Ｌ活性炭（ｐＨ ５．８）。

以上各固體培養(yǎng)基瓊脂為７．５ ｇ／Ｌ。光照培養(yǎng)的光照度為１ ５００～２ ０００ ｌｘ，每天光照１４ ｈ。

１．３檸檬再生體系的建立及優(yōu)化

上胚軸的獲得：將檸檬果實破碎取出種子，用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ浸泡１０ ｍｉｎ去除種子表面的果膠，再用自來水漂洗干凈，在超凈工作臺上用７０％乙醇浸泡２～３ ｍｉｎ，用２％次氯酸鈉浸泡滅菌２０ ｍｉｎ，中間搖動數次，棄去次氯酸鈉溶液，用無菌水洗滌３次，每次５ ｍｉｎ；將上述滅菌的種子在超凈工作臺上剝去內外種皮，置于裝有ＭＴ培養(yǎng)基的試管中（２６±１） ℃暗培養(yǎng)，２０ ｄ后取上胚軸進行試驗。

添加不同濃度的６－ＢＡ和０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ到ＭＴ培養(yǎng)基配方中，研究各配方對檸檬上胚軸再生不定芽的影響。將切好的上胚軸莖段平放在培養(yǎng)基平板上，用Ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口，在（２６±１） ℃下暗培養(yǎng)１０ ｄ后轉至光照培養(yǎng)，６０ ｄ后統(tǒng)計再生芽數量。

１．４農桿菌的培養(yǎng)及浸染液的制備

參照王關林等［９］的方法進行農桿菌的培養(yǎng)及浸染液的制備。

1.5共培養(yǎng)

將農桿菌侵染后的檸檬上胚軸切段置于干燥的無菌濾紙上，吸去切段上附著的農桿菌菌液，然后將轉化后的切段置于覆蓋濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，采用Parafilm膜密封后置于22 ℃的培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，分不同時間（0、2、3 d）統(tǒng)計再生芽數量。

１．6抗生素敏感性試驗

檸檬上胚軸切段分別置于含不同濃度潮霉素（０、２．５、５．０、７．５、１０．０ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基上，（２６±１） ℃下暗培養(yǎng)１０ ｄ，轉入１４／１０ ｈ光周期條件下培養(yǎng)。每個處理３皿，每皿接入２５個外植體，３次重復，６０ ｄ后進行統(tǒng)計外植體的發(fā)芽數及再生頻率。

１．7農桿菌菌液浸染試驗

用ＭＴ懸浮培養(yǎng)基將上述培養(yǎng)好的農桿菌菌液稀釋至所需濃度０～１．０（以ＯＤ６００ ｎｍ值計算）。每個濃度梯度侵染至少２５個外植體，３次重復。

１．８不定芽的再生及ＰＣＲ鑒定

在添加潮霉素的ＭＴ培養(yǎng)基上篩選４個月后，將再生的不定芽（長１ ｃｍ左右）切下，在溫室枳砧上嫁接。取再生植株的葉片，采用ＣＴＡＢ法提取其ＤＮＡ。根據載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ上的ＧＵＳ基因序列設計引物（ＧＳ１－５′ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧ ３′，ＧＡ１－５′ＣＧＣＴＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣ ３′）。

１．9數據分析

所有處理的外植體每２０ ｄ繼代一次。再生頻率（再生頻率＝生芽的外植體數／總外植體數）數據統(tǒng)計在轉化１２０ ｄ后進行。采用ＳＡＳ ８．０軟件進行數據分析，差異顯著性采用鄧肯氏新復極差法分析，百分數經過反正弦轉換后進行分析。

２結果與分析

２．１不同濃度６－ＢＡ對檸檬上胚軸再生的影響

選用ＭＴ培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對添加不同濃度的６－ＢＡ和固定濃度ＮＡＡ（０．１ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基組合進行試驗。結果（表１）表明，在不添加６－ＢＡ或６－ＢＡ含量為０．５ ｍｇ／Ｌ時，檸檬上胚軸的再生率較低。ＭＴ培養(yǎng)基中添加１．０或１．５ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ有利于檸檬不定芽的再生，再生率分別達６８．３％和７０．３％，但添加１．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ導致部分再生芽畸形、叢生。隨著６－ＢＡ濃度的增加，這種現象更加嚴重，添加２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基，產生的不定芽大部分畸形、叢生，不能再生。因此，選擇添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基為檸檬再生的誘導培養(yǎng)基。

２．２不同濃度潮霉素對檸檬上胚軸再生的影響

從表２可以看出，在誘導培養(yǎng)基中添加２．５ ｍｇ／Ｌ的潮霉素，對檸檬上胚軸不定芽的再生產生抑制作用，與不添加潮霉素相比，其不定芽再生率由５０．７％下降為２５．３％；在培養(yǎng)基中添加７．５ ｍｇ／Ｌ以上濃度的潮霉素，強烈抑制檸檬不定芽的再生。

２．３不同濃度農桿菌對檸檬上胚軸再生的影響

農桿菌菌液濃度對遺傳轉化的影響較大。菌液的濃度過低時，沒有足夠的農桿菌附著于外植體切口；菌液的濃度過高，導致外植體的切口褐化，影響不定芽的再生并導致農桿菌的過度生長，增加后面組織培養(yǎng)抑菌的難度。

從表３可以看出，在ＯＤ６００ ｎｍ值０～０．６的范圍內，隨著農桿菌菌液濃度的增加，檸檬上胚軸的再生率不斷增加，在ＯＤ６００ ｎｍ值為０．６時，檸檬上胚軸再生率達到最大值，為１２．０％；在ＯＤ６００ ｎｍ值大于０．６之后，隨著農桿菌菌液濃度的提高，檸檬上胚軸再生率呈下降趨勢，而且外植體切口的褐化程度也不斷加深。因此，確定檸檬上胚軸轉化的最適宜農桿菌菌液濃度為０．６（ＯＤ６００ ｎｍ）。

２．４共培養(yǎng)時間對檸檬上胚軸再生的影響

在遺傳轉化后，將轉化的材料在２２ ℃的條件下進行共培養(yǎng)。從表４可以看出，轉化后共培養(yǎng)２～３ ｄ，可以顯著提高檸檬上胚軸的再生率。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，容易造成農桿菌的過度生長，造成污染，反而使再生率下降。

２．５再生植株的ＰＣＲ鑒定

利用ＰＣＲ技術對１６株轉基因檸檬再生植株進行檢測，結果（圖１）表明，其中有９株為陽性植株，再生植株率為５６％。

３小結與討論

柑橘遺傳轉化的環(huán)節(jié)比較多，影響其再生和轉化的因素也很多，植物激素的種類和濃度、共培養(yǎng)的條件、農桿菌浸染的時間和濃度都會對再生頻率產生影響［９，１０］。其中共培養(yǎng)是遺傳轉化中關鍵的一環(huán)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇、濾紙的使用、共培養(yǎng)時間的長短、溫度的高低、轉化誘導物如乙酰丁香酮的使用與否都會對轉化效率產生直接的影響［１１］。

農桿菌侵染外植體后，轉化不能立即發(fā)生，只有農桿菌在創(chuàng)傷部位生存１６ ｈ才能誘發(fā)Ｔ－ＤＮＡ的轉移和整合，完成轉化。理論上說，農桿菌侵染的時間越長，發(fā)生轉化的頻率越高。但在實際操作中，農桿菌侵染的時間過長，容易導致農桿菌的過度生長，給隨后的組織培養(yǎng)和再生造成困難［１２］。

本研究建立并優(yōu)化了檸檬的遺傳轉化體系，１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．１ ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ有利于檸檬上胚軸不定芽的再生，并且得到再生芽的質量最佳。農桿菌的浸染濃度以ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６為最佳，浸染后共培養(yǎng)２ ｄ，在含５．０ ｍｇ／Ｌ潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，有利于檸檬不定芽的再生率的提高。因為轉基因載體所用的篩選標記為潮霉素抗性基因，所以需要用潮霉素作為篩選抗生素，但是這種抗生素對柑橘的不定芽再生有一定的抑制作用。雖然較高濃度的潮霉素有利于篩選出抗性不定芽，但是也會強烈抑制不定芽的再生，因此選擇合適的潮霉素濃度，以保證在篩選效果和再生能力之間取得一個較好的平衡。該優(yōu)化遺傳轉化體系的建立，為利用檸檬在柑橘類植物中最不耐寒的特性，驗證柑橘抗寒相關基因或啟動子功能奠定基礎。

參考文獻：

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［２］ ＣＥＲＶＥＲＡ Ｍ，ＮＡＶＡＲＲＯ Ａ， ＮＡＶＡＲＲＯ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｄｕｌｔ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅ ｍａｎｄａｒｉｎ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｔｒｅｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，２８（1）：５５－６６．

［３］ ＧＯＭＥＺ－ＬＩＭ Ｍ Ａ， ＬＩＴＺ Ｒ Ｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｆｒｕｉｔｓ ［Ｊ］． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎｔ，２００４，４０（5）：４４２－４４９．

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［５］ ＴＯＮＧ Ｚ， ＴＡＮ Ｂ， ＺＨＡＮＧ Ｊ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｕｓｉｎｇ ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ｏｒａｎｇｅ （Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ ［Ｌ．］ Ｒａｆ．） ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｈｏｒｔ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｉｔｒｕｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００９，１１９（3）：３３５－３３８．

［６］ ＰＥＮＡ Ｌ， ＰＥＲＥＺ Ｒ Ｍ， ＣＥＲＶＥＲＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｂｏｔ，２００４，９４（1）：６７－７４．

［７］ 黃家權，尹黎燕，楊曉紅，等．影響‘尤力克檸檬不定芽發(fā)生主要因素的研究［Ｊ］．園藝學報，２００５，３２（２）：２０６－２０６．

［８］ ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ Ｔ， ＴＵＣＫＥＲ Ｄ Ｐ Ｈ． Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｉｔｒｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ［A］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ３［C］． California： Rublications Department of the University of California，１９６９. １１１５－１１６１．

［９］ 王關林，方宏筠．植物基因工程［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００３．

［１０］ 黃家權，鄔志榮，孫中海．影響椪柑上胚軸再生不定芽的幾個生理因素［Ｊ］．植物生理學通訊，２００５，４１（１）：３７－４０．

［１１］ 王子成，鄧秀新． 柑橘轉基因研究進展［Ｊ］．華中農業(yè)大學學報，２００２，２１（５）：４９４－４９９．

［１２］ Ｌｉ Ｄ Ｄ， ＳＨＩ Ｗ， ＤＥＮＧ Ｘ Ｘ． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｌｅｎｃｉａ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ） ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐＴＡ２９－ｂａｒｎａｓｅ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｔｒｅｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，２３（1）：１２０９－１２１５．

檸檬上胚軸切段分別置于含不同濃度潮霉素（０、２．５、５．０、７．５、１０．０ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基上，（２６±１） ℃下暗培養(yǎng)１０ ｄ，轉入１４／１０ ｈ光周期條件下培養(yǎng)。每個處理３皿，每皿接入２５個外植體，３次重復，６０ ｄ后進行統(tǒng)計外植體的發(fā)芽數及再生頻率。

１．7農桿菌菌液浸染試驗

用ＭＴ懸浮培養(yǎng)基將上述培養(yǎng)好的農桿菌菌液稀釋至所需濃度０～１．０（以ＯＤ６００ ｎｍ值計算）。每個濃度梯度侵染至少２５個外植體，３次重復。

１．８不定芽的再生及ＰＣＲ鑒定

在添加潮霉素的ＭＴ培養(yǎng)基上篩選４個月后，將再生的不定芽（長１ ｃｍ左右）切下，在溫室枳砧上嫁接。取再生植株的葉片，采用ＣＴＡＢ法提取其ＤＮＡ。根據載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ上的ＧＵＳ基因序列設計引物（ＧＳ１－５′ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧ ３′，ＧＡ１－５′ＣＧＣＴＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣ ３′）。

１．9數據分析

所有處理的外植體每２０ ｄ繼代一次。再生頻率（再生頻率＝生芽的外植體數／總外植體數）數據統(tǒng)計在轉化１２０ ｄ后進行。采用ＳＡＳ ８．０軟件進行數據分析，差異顯著性采用鄧肯氏新復極差法分析，百分數經過反正弦轉換后進行分析。

２結果與分析

２．１不同濃度６－ＢＡ對檸檬上胚軸再生的影響

選用ＭＴ培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對添加不同濃度的６－ＢＡ和固定濃度ＮＡＡ（０．１ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基組合進行試驗。結果（表１）表明，在不添加６－ＢＡ或６－ＢＡ含量為０．５ ｍｇ／Ｌ時，檸檬上胚軸的再生率較低。ＭＴ培養(yǎng)基中添加１．０或１．５ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ有利于檸檬不定芽的再生，再生率分別達６８．３％和７０．３％，但添加１．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ導致部分再生芽畸形、叢生。隨著６－ＢＡ濃度的增加，這種現象更加嚴重，添加２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基，產生的不定芽大部分畸形、叢生，不能再生。因此，選擇添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基為檸檬再生的誘導培養(yǎng)基。

２．２不同濃度潮霉素對檸檬上胚軸再生的影響

從表２可以看出，在誘導培養(yǎng)基中添加２．５ ｍｇ／Ｌ的潮霉素，對檸檬上胚軸不定芽的再生產生抑制作用，與不添加潮霉素相比，其不定芽再生率由５０．７％下降為２５．３％；在培養(yǎng)基中添加７．５ ｍｇ／Ｌ以上濃度的潮霉素，強烈抑制檸檬不定芽的再生。

２．３不同濃度農桿菌對檸檬上胚軸再生的影響

農桿菌菌液濃度對遺傳轉化的影響較大。菌液的濃度過低時，沒有足夠的農桿菌附著于外植體切口；菌液的濃度過高，導致外植體的切口褐化，影響不定芽的再生并導致農桿菌的過度生長，增加后面組織培養(yǎng)抑菌的難度。

從表３可以看出，在ＯＤ６００ ｎｍ值０～０．６的范圍內，隨著農桿菌菌液濃度的增加，檸檬上胚軸的再生率不斷增加，在ＯＤ６００ ｎｍ值為０．６時，檸檬上胚軸再生率達到最大值，為１２．０％；在ＯＤ６００ ｎｍ值大于０．６之后，隨著農桿菌菌液濃度的提高，檸檬上胚軸再生率呈下降趨勢，而且外植體切口的褐化程度也不斷加深。因此，確定檸檬上胚軸轉化的最適宜農桿菌菌液濃度為０．６（ＯＤ６００ ｎｍ）。

２．４共培養(yǎng)時間對檸檬上胚軸再生的影響

在遺傳轉化后，將轉化的材料在２２ ℃的條件下進行共培養(yǎng)。從表４可以看出，轉化后共培養(yǎng)２～３ ｄ，可以顯著提高檸檬上胚軸的再生率。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，容易造成農桿菌的過度生長，造成污染，反而使再生率下降。

２．５再生植株的ＰＣＲ鑒定

利用ＰＣＲ技術對１６株轉基因檸檬再生植株進行檢測，結果（圖１）表明，其中有９株為陽性植株，再生植株率為５６％。

３小結與討論

柑橘遺傳轉化的環(huán)節(jié)比較多，影響其再生和轉化的因素也很多，植物激素的種類和濃度、共培養(yǎng)的條件、農桿菌浸染的時間和濃度都會對再生頻率產生影響［９，１０］。其中共培養(yǎng)是遺傳轉化中關鍵的一環(huán)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇、濾紙的使用、共培養(yǎng)時間的長短、溫度的高低、轉化誘導物如乙酰丁香酮的使用與否都會對轉化效率產生直接的影響［１１］。

農桿菌侵染外植體后，轉化不能立即發(fā)生，只有農桿菌在創(chuàng)傷部位生存１６ ｈ才能誘發(fā)Ｔ－ＤＮＡ的轉移和整合，完成轉化。理論上說，農桿菌侵染的時間越長，發(fā)生轉化的頻率越高。但在實際操作中，農桿菌侵染的時間過長，容易導致農桿菌的過度生長，給隨后的組織培養(yǎng)和再生造成困難［１２］。

本研究建立并優(yōu)化了檸檬的遺傳轉化體系，１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．１ ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ有利于檸檬上胚軸不定芽的再生，并且得到再生芽的質量最佳。農桿菌的浸染濃度以ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６為最佳，浸染后共培養(yǎng)２ ｄ，在含５．０ ｍｇ／Ｌ潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，有利于檸檬不定芽的再生率的提高。因為轉基因載體所用的篩選標記為潮霉素抗性基因，所以需要用潮霉素作為篩選抗生素，但是這種抗生素對柑橘的不定芽再生有一定的抑制作用。雖然較高濃度的潮霉素有利于篩選出抗性不定芽，但是也會強烈抑制不定芽的再生，因此選擇合適的潮霉素濃度，以保證在篩選效果和再生能力之間取得一個較好的平衡。該優(yōu)化遺傳轉化體系的建立，為利用檸檬在柑橘類植物中最不耐寒的特性，驗證柑橘抗寒相關基因或啟動子功能奠定基礎。

參考文獻：

［１］ ＰＥＮＡ Ｌ，ＣＥＲＶＥＲ Ａ Ｍ，ＧＨＯＲＢＥＬ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ pｅｒｅｎｎｉａｌ fｒｕｉｔ tｒｅｅｓ［A］． Ｋｈａｎ Ｉ Ａ． Ｃｉｔｒｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［M］． UK：ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００７. ３２９－３４４．

［２］ ＣＥＲＶＥＲＡ Ｍ，ＮＡＶＡＲＲＯ Ａ， ＮＡＶＡＲＲＯ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｄｕｌｔ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅ ｍａｎｄａｒｉｎ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｔｒｅｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，２８（1）：５５－６６．

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［４］ ＴＡＬＯＮ Ｍ， ＧＭＩＴＴＥＲ Ｆ Ｇ． Ｃｉｔｒｕｓ gｅｎｏｍｉｃｓ ［Ｊ/OL］． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８. http：//dx.doi.org/10.1155/2008/528361.

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［６］ ＰＥＮＡ Ｌ， ＰＥＲＥＺ Ｒ Ｍ， ＣＥＲＶＥＲＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｂｏｔ，２００４，９４（1）：６７－７４．

［７］ 黃家權，尹黎燕，楊曉紅，等．影響‘尤力克檸檬不定芽發(fā)生主要因素的研究［Ｊ］．園藝學報，２００５，３２（２）：２０６－２０６．

［８］ ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ Ｔ， ＴＵＣＫＥＲ Ｄ Ｐ Ｈ． Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｉｔｒｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ［A］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ３［C］． California： Rublications Department of the University of California，１９６９. １１１５－１１６１．

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［１１］ 王子成，鄧秀新． 柑橘轉基因研究進展［Ｊ］．華中農業(yè)大學學報，２００２，２１（５）：４９４－４９９．

［１２］ Ｌｉ Ｄ Ｄ， ＳＨＩ Ｗ， ＤＥＮＧ Ｘ Ｘ． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｌｅｎｃｉａ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ） ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐＴＡ２９－ｂａｒｎａｓｅ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｔｒｅｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，２３（1）：１２０９－１２１５．

檸檬上胚軸切段分別置于含不同濃度潮霉素（０、２．５、５．０、７．５、１０．０ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基上，（２６±１） ℃下暗培養(yǎng)１０ ｄ，轉入１４／１０ ｈ光周期條件下培養(yǎng)。每個處理３皿，每皿接入２５個外植體，３次重復，６０ ｄ后進行統(tǒng)計外植體的發(fā)芽數及再生頻率。

１．7農桿菌菌液浸染試驗

用ＭＴ懸浮培養(yǎng)基將上述培養(yǎng)好的農桿菌菌液稀釋至所需濃度０～１．０（以ＯＤ６００ ｎｍ值計算）。每個濃度梯度侵染至少２５個外植體，３次重復。

１．８不定芽的再生及ＰＣＲ鑒定

在添加潮霉素的ＭＴ培養(yǎng)基上篩選４個月后，將再生的不定芽（長１ ｃｍ左右）切下，在溫室枳砧上嫁接。取再生植株的葉片，采用ＣＴＡＢ法提取其ＤＮＡ。根據載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ上的ＧＵＳ基因序列設計引物（ＧＳ１－５′ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧ ３′，ＧＡ１－５′ＣＧＣＴＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣ ３′）。

１．9數據分析

所有處理的外植體每２０ ｄ繼代一次。再生頻率（再生頻率＝生芽的外植體數／總外植體數）數據統(tǒng)計在轉化１２０ ｄ后進行。采用ＳＡＳ ８．０軟件進行數據分析，差異顯著性采用鄧肯氏新復極差法分析，百分數經過反正弦轉換后進行分析。

２結果與分析

２．１不同濃度６－ＢＡ對檸檬上胚軸再生的影響

選用ＭＴ培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對添加不同濃度的６－ＢＡ和固定濃度ＮＡＡ（０．１ ｍｇ／Ｌ）的培養(yǎng)基組合進行試驗。結果（表１）表明，在不添加６－ＢＡ或６－ＢＡ含量為０．５ ｍｇ／Ｌ時，檸檬上胚軸的再生率較低。ＭＴ培養(yǎng)基中添加１．０或１．５ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ有利于檸檬不定芽的再生，再生率分別達６８．３％和７０．３％，但添加１．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ導致部分再生芽畸形、叢生。隨著６－ＢＡ濃度的增加，這種現象更加嚴重，添加２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基，產生的不定芽大部分畸形、叢生，不能再生。因此，選擇添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)基為檸檬再生的誘導培養(yǎng)基。

２．２不同濃度潮霉素對檸檬上胚軸再生的影響

從表２可以看出，在誘導培養(yǎng)基中添加２．５ ｍｇ／Ｌ的潮霉素，對檸檬上胚軸不定芽的再生產生抑制作用，與不添加潮霉素相比，其不定芽再生率由５０．７％下降為２５．３％；在培養(yǎng)基中添加７．５ ｍｇ／Ｌ以上濃度的潮霉素，強烈抑制檸檬不定芽的再生。

２．３不同濃度農桿菌對檸檬上胚軸再生的影響

農桿菌菌液濃度對遺傳轉化的影響較大。菌液的濃度過低時，沒有足夠的農桿菌附著于外植體切口；菌液的濃度過高，導致外植體的切口褐化，影響不定芽的再生并導致農桿菌的過度生長，增加后面組織培養(yǎng)抑菌的難度。

從表３可以看出，在ＯＤ６００ ｎｍ值０～０．６的范圍內，隨著農桿菌菌液濃度的增加，檸檬上胚軸的再生率不斷增加，在ＯＤ６００ ｎｍ值為０．６時，檸檬上胚軸再生率達到最大值，為１２．０％；在ＯＤ６００ ｎｍ值大于０．６之后，隨著農桿菌菌液濃度的提高，檸檬上胚軸再生率呈下降趨勢，而且外植體切口的褐化程度也不斷加深。因此，確定檸檬上胚軸轉化的最適宜農桿菌菌液濃度為０．６（ＯＤ６００ ｎｍ）。

２．４共培養(yǎng)時間對檸檬上胚軸再生的影響

在遺傳轉化后，將轉化的材料在２２ ℃的條件下進行共培養(yǎng)。從表４可以看出，轉化后共培養(yǎng)２～３ ｄ，可以顯著提高檸檬上胚軸的再生率。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，容易造成農桿菌的過度生長，造成污染，反而使再生率下降。

２．５再生植株的ＰＣＲ鑒定

利用ＰＣＲ技術對１６株轉基因檸檬再生植株進行檢測，結果（圖１）表明，其中有９株為陽性植株，再生植株率為５６％。

３小結與討論

柑橘遺傳轉化的環(huán)節(jié)比較多，影響其再生和轉化的因素也很多，植物激素的種類和濃度、共培養(yǎng)的條件、農桿菌浸染的時間和濃度都會對再生頻率產生影響［９，１０］。其中共培養(yǎng)是遺傳轉化中關鍵的一環(huán)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇、濾紙的使用、共培養(yǎng)時間的長短、溫度的高低、轉化誘導物如乙酰丁香酮的使用與否都會對轉化效率產生直接的影響［１１］。

農桿菌侵染外植體后，轉化不能立即發(fā)生，只有農桿菌在創(chuàng)傷部位生存１６ ｈ才能誘發(fā)Ｔ－ＤＮＡ的轉移和整合，完成轉化。理論上說，農桿菌侵染的時間越長，發(fā)生轉化的頻率越高。但在實際操作中，農桿菌侵染的時間過長，容易導致農桿菌的過度生長，給隨后的組織培養(yǎng)和再生造成困難［１２］。

本研究建立并優(yōu)化了檸檬的遺傳轉化體系，１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．１ ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ有利于檸檬上胚軸不定芽的再生，并且得到再生芽的質量最佳。農桿菌的浸染濃度以ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６為最佳，浸染后共培養(yǎng)２ ｄ，在含５．０ ｍｇ／Ｌ潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，有利于檸檬不定芽的再生率的提高。因為轉基因載體所用的篩選標記為潮霉素抗性基因，所以需要用潮霉素作為篩選抗生素，但是這種抗生素對柑橘的不定芽再生有一定的抑制作用。雖然較高濃度的潮霉素有利于篩選出抗性不定芽，但是也會強烈抑制不定芽的再生，因此選擇合適的潮霉素濃度，以保證在篩選效果和再生能力之間取得一個較好的平衡。該優(yōu)化遺傳轉化體系的建立，為利用檸檬在柑橘類植物中最不耐寒的特性，驗證柑橘抗寒相關基因或啟動子功能奠定基礎。

參考文獻：

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［４］ ＴＡＬＯＮ Ｍ， ＧＭＩＴＴＥＲ Ｆ Ｇ． Ｃｉｔｒｕｓ gｅｎｏｍｉｃｓ ［Ｊ/OL］． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８. http：//dx.doi.org/10.1155/2008/528361.

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