紅景天苷對內皮祖細胞功能及其PI3K/Akt通路的影響*

周芝蘭， 王林靜， 劉革修， 朱錦燦， 陳小宇， 劉善淘

(1國防科技大學醫院，湖南 長沙 410073； 2廣東藥學院公共衛生學院，廣東 廣州 510006；3暨南大學醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

藏藥紅景天不僅在抗疲勞、抗缺氧、延緩衰老等保健制劑方面被廣泛接受，而且在心腦血管疾病治療方面也顯示顯著效果[1-2]。研究顯示其重要提取物紅景天苷(salidroside，Sal)具有擴張阻力血管和容量血管、降低周圍阻力，使動脈血壓和左室舒張末壓下降。說明其對血管平滑肌細胞或者內皮細胞具有重要作用。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，具有增殖、分化成新生血管和更新與修復動脈內皮的功能，在創傷愈合和心血管系統中具有重要作用，EPCs數量已被作為心血管疾病診斷及預后評價的重要指標[3-5]。本文通過研究紅景天苷對內皮祖細胞功能的影響并初步了解其信號途徑機制，為紅景天的應用提供基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

內皮細胞基礎培養基2(endothelial basal me-dium-2，EBM-2)和內皮細胞生長培養基-2(endothelial growth medium-2，EGM-2)購自Clonetics；人纖維連接蛋白(human fibronectin,HFN)購自Chemicon；FITC-UEA-I 為Sigma 產品; acLDL-DiI 購自Molecular Probe;小鼠抗人Akt單克隆抗體和小鼠抗人磷酸化Akt單克隆抗體(Millipore)；小鼠抗人GAPDH (Chemicon International)；Transwell小室購自Corning；紅景天苷購自中國食品藥品檢定所；PI3K抑制劑LY294002 (Sigma)用DMSO配制成1 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存。

2 EPCs的分離與培養

5名在校健康志愿男生，年齡18～21歲，肘靜脈取血45 mL，肝素抗凝，Ficoll液密度梯度離心法獲取單個核細胞，PBS洗滌2次后種于含20% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養基、HFN(5 μg/cm2)包被的培養板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養。4 d后用PBS 洗去非貼壁細胞, 換培養液，6 d后用PBS洗掉非貼壁細胞, 貼壁細胞供實驗用。每份血液完成1組實驗, 包括對照組和藥物干預組的EPCs數量及功能檢測。

3 方法

3.1MTT法檢測Sal對EPCs增殖的影響 EPCs 培養7 d 后，用0.25%胰酶消化內皮祖細胞，接種到HFN包被的96孔培養板，培養24 h、48 h或72 h后，每孔加MTT (5 g/L)10 μL，培養4 h。棄去上清液，再加入DMSO(150 μL/well)充分振蕩10 min后，在酶標儀下于波長490 nm處測吸光度(A)值。實驗分成8組: (1) 對照組: 含10% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養基培養；(2) Sal各濃度組(共7組): 在含10% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養基中加入Sal(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μmol/L)；(3) LY294002組：Sal+LY294002，選擇20 μmol/L Sal是根據預實驗結果，選擇10 μmol/L LY294002是根據文獻資料。紅景天苷用培養基配制。設3復孔。

3.2細胞染色與鑒定 培養7 d后去培養基，PBS洗2遍，加稀釋的acLDL-DiI(用培養基按1∶100稀釋)，37 ℃下孵育2 h，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2遍后，1%曲拉通孵育20 min，PBS洗2遍，加1∶100稀釋的lectin孵育1 h，PBS洗2遍，DAPI染色，熒光顯微鏡下鑒定UEA-I和acLDL 雙染色陽性的EPCs,隨機選擇10個×200 視野計數。

3.3EPCs 黏附能力檢測 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞, 收集、懸浮在500 μL培養液, 計數。然后將同等數目的EPCs 接種在HFN包被的培養板，Sal干預，在37 ℃下培養30 min,計數貼壁細胞。

3.4EPCs 遷移能力檢測 用0.25%胰酶消化經鑒定的細胞, 收集并計數。將含不同濃度Sal 500 μL培養液加入Transwell小室的下室, 含1×104EPCs 培養液100 μL注入上室, Sal干預，培養24 h, 刮去濾膜上面的未移動細胞, 用甲醇固定, Giemsa 染色, 隨機選擇3 個顯微鏡視野(×400), 計數遷移的細胞。

3.5細胞一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測 收集各組細胞培養上清，按NO檢測試劑盒操作說明，通過比色法測知NO濃度。

3.6Westertn blotting檢測細胞Akt蛋白的表達 處理24 h后收集細胞提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進行10% SDS-PAGE及轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入稀釋的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的相應Ⅱ抗IgG(1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。化學熒光法檢測 (Boehringer Mannheim)，采集圖像，采用Gelpro4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內參照。

4 統計學處理

采用SPSS 15.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)；計數資料采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EPCs 的培養與鑒定

分離獲得的單個核細胞經過內皮細胞培養基培養7 d 后形成了圓形或梭形細胞。采用DAPI(圖1A)、FITC-UEA-I(圖1B)和acLDL-DiI(圖1C)對細胞染色后, 通過熒光顯微鏡可以觀察到, 大部分細胞呈UEA-I和acLDL染色陽性，為EPCs。

2 Sal對EPCs增殖的影響

結果顯示，在2.5～160 μmol/L濃度范圍內，不同濃度的Sal與EPCs培養均能顯著促進EPCs增殖,并且隨著濃度的增加EPCs數量增加。2.5 μmol/L Sal在48h時與對照組相比有明顯差異，10 μmol/L Sal在24 h時即有明顯差異，80 μmol/L Sal則產生最大效應，72 h時較對照組增加了1.67倍(P<0.05)，而LY294002(10 μmol/L)則能抑制紅景天苷的促EPCs增殖作用，見表1。

Figure 1. Identification of EPCs (×200). A: the nuclei of adherent cells with DAPI were blue; B: cells binding to FITC-UEAI were green; C: adherent cells with acLDL-DiI were red.

3 Sal對EPCs 遷移功能的影響

采用Transwell小室檢測Sal對EPCs 遷移功能的影響, 在400倍顯微鏡下計數遷移的細胞結果顯示，Sal明顯改善了EPCs 的遷移功能。2.5 μmol/L Sal組遷移的細胞數是49±14，是對照組(32±11)的1.5倍(P<0.05)；80 μmol/L Sal效果最顯著，其遷移的細胞數是對照組4.3倍(P<0.05),見圖2。

4 Sal對EPCs 黏附能力的影響

結果顯示, Sal作用24 h顯著增加了貼壁細胞數，并且貼壁細胞數隨著Sal濃度的增加而增加, 5 μmol/L Sal組即有顯著增加(P<0.05), 80 μmol/L Sal組達到最大效應，見圖3。2.5 μmol/L Sal組與對照組比無顯著差異。

表1 MTT法檢測Sal對EPCs增殖的作用

Figure 2. The effects of Sal on the migration of EPCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

5 Sal對EPCs合成NO的影響

結果顯示，在2.5～160 μmol/L Sal濃度范圍內，不同濃度的Sal與EPCs培養均能顯著促進EPCs合成NO，并且隨著濃度的增加，NO的合成也增加, 48 h時2.5 μmol/L Sal組培養基中NO的濃度為(16.75±3.41) μmol/L，與對照組[(11.63±3.30) μmol/L]比有明顯差異(P<0.05)；80.0 μmol/L Sal則產生最大效應[(21.63±3.49) μmol/L]，較對照組增加了1.86倍,見圖4。

Figure 3. Effects of Sal on adhesion of EPCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

6 紅景天苷對EPCs內Akt蛋白水平的影響

結果顯示，Sal (20 μmol/L)對細胞內Akt總蛋白水平影響不明顯，但顯著增加p-Akt蛋白水平；LY294002(10 μmol/L)則能抑制Sal增加p-Akt蛋白水平，見圖5。而且LY+Sal組的p-Akt比對照組少。

Figure 4. The effects of Sal on NO secretion from EPCs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

這是因為對照組EPCs本身處于增殖狀態，且存在PI3K/Akt通路活化，應用LY294002則抑制了該部分PI3K和紅景天苷將激活的PI3K，所以，LY+Sal組p-Akt蛋白水平較對照組下降。這些結果說明Sal 能影響PI3K/Akt活性。

Figure 5. The effects of Sal on the Akt protein expression and phosphorylation in EPCs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs Sal.

討 論

EPCs數量已被作為心血管疾病診斷及預后評價的重要指標[3-5]。本研究結果顯示，Sal 在2.5～160 μmol/L濃度范圍內，不僅顯著促進EPCs增殖,而且增強EPCs的功能，促進EPCs黏附、遷移以及NO合成。EPCs數量增加、黏附和遷移能力增強，則可以促進新生血管形成，促進創傷愈合；NO則可以改善心血管舒張功能。所以，在臨床上，Sal可應用于創傷或者心血管疾病的防治，促進患者康復。本研究結果也顯示，Sal可增加EPCs的PI3K/Akt信號通路活性，該信號通路的抑制劑LY294002(10 μmol/L)則能抑制Sal的作用。PI3K參與調節細胞內許多重要生命活動，控制細胞周期進程、細胞分化、細胞存活、細胞侵襲和轉移以及血管生成等信號途徑[6-9]。PI3K的一些生物學效應是通過其下游靶分子Akt的激活介導的。Akt被激活則可誘導細胞核反應、促進基因表達，導致細胞增殖與分化[6-7]。另外，內皮型一氧化氮合酶磷酸化活化也受其調節，從而影響NO合成，調節血管活性并促進內皮祖細胞增殖分化[6-7]。總之，Sal通過PI3K/Akt通路調節EPCs的生物學活性與功能。這部分解析了紅景天中藥制劑在臨床心血管疾病中的應用機制。

[參 考 文 獻]

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