野木瓜注射液對炎性疼痛小鼠背根神經節COX-2表達的影響*

楊燕京, 李小軍, 劉力維, 郭 強, 李玉桑, 奉黎靜, 唐和斌

(中南民族大學藥學院藥理學研究室，湖北 武漢 430074)

野木瓜為木通科(Lardizabalaceae)野木瓜屬植物，拉丁學名StauntoniachinensisDC.，有強心利尿、驅蟲止痛之功效[1]。野木瓜注射液(injection staun-toniae，IS)是從野木瓜中提取的有效成分，通過加工提取精制而成的一種中藥注射液[2]。已有許多文獻和臨床試驗觀察表明，野木瓜注射液具有抗炎消腫和止痛作用，可用于各種術后止痛、卒中后肩痛、臀上皮神經卡壓綜合癥等[1]。彭小莉等[3]證實野木瓜注射液能預防和緩解大鼠足底皮下化學組織損傷誘致的持續性自發痛；劉向明等[4]利用微電極細胞外記錄技術，觀察得出野木瓜注射液可以在外周水平上阻滯Wistar大鼠痛覺信息的傳導，是其產生鎮痛作用的原因之一。然而尚未見野木瓜注射液經治療炎性疼痛反應與環氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)表達有關的研究報道。COX-2是前列腺素合成的一種誘導型限速酶，催化前列腺素合成參與炎癥反應[5]。本文從疼痛行為學和細胞生物學角度出發，研究野木瓜注射液對足底慢性炎癥疼痛模型小鼠背根神經節細胞內COX-2的表達干預及抗炎鎮痛的作用，為其臨床應用和推廣提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

SPF級昆明小鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，體質量20～25 g，雄性，許可證號SCXK(鄂)2008-0005；野木瓜注射液(廣東和平制藥，2 mL×6，含總黃酮不少于0.24 mg)；角叉菜膠(Sigma)；COX-2蛋白免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；足底測痛儀。

2 動物分組

動物的飼養環境為溫度22～25 ℃，濕度30%～40%。小鼠適應性飼養5 d后，將60只小鼠隨機均分為5組，每組12只：(1) 對照組；(2) 模型組；(3) 低劑量野木瓜注射液治療組；(4) 中劑量野木瓜注射液治療組；(5) 高劑量野木瓜注射液治療組。所有動物實驗和處理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”[6]。

3 方法

造模開始前，分別檢測各組小鼠足趾腫脹程度和熱痛閾值，與各組小鼠(除對照組注射50 μL生理鹽水)左后足一次性皮內注射50 μL 1%角叉菜膠，建立小鼠慢性炎性疼痛模型，造模后，即刻采取背部皮下注射方式給藥，其中治療組小鼠分別給予1.2 μL/g相應劑量的野木瓜注射液；模型組和對照組給予等劑量的注射用水。在造模后4 h、12 h、24 h和48 h檢測各組小鼠足趾腫脹程度和熱痛閾值，并取小鼠背根神經節進行COX-2免疫組化染色。

3.1小鼠足趾大體觀察方法 足趾腫脹測量：采用

足趾容積測量儀測定小鼠足趾的腫脹體積。固定小鼠后足，在踝關節處作一標記線，將小鼠后足浸入測量儀的液體中，浸入的深度以標記線為界，然后取出小鼠足趾，記錄液體的排出量，即為小鼠的足趾體積，計算小鼠造模4 h、12 h、24 h和48 h后不同時點的足趾腫脹程度。每只小鼠均重復3次實驗，取3次實驗結果的平均值。時點的足趾腫脹程度(%)=(時點的足趾體積-注射前足趾體積)/ 注射前足趾體積×100%。

3.2小鼠行為學測試方法 熱痛閾值的測定：將小鼠放置于足底測痛儀玻璃板上的格子里，待其安靜后，開啟玻璃板下方的紅外輻射燈照射其足底，依據記錄儀器上所顯示的時間，測定小鼠足底熱痛閾值。每只小鼠均重復3次實驗，每次至少間隔5 min，取3次實驗結果的平均值。

3.3小鼠背根神經節L5 DRG細胞中COX-2的表達 斷頭處死小鼠后取小鼠第5腰椎(lumbar 5, L5)背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)固定并且石蠟包埋，進行COX-2蛋白的免疫組織化學染色。COX-2蛋白陽性表達時呈棕黃色片狀或顆粒狀，根據陽性細胞分布情況，每張切片選取3個不同的視野，采用Image-Pro Plus圖像分析系統半定量計算COX-2蛋白的表達[7]。

4 統計學處理

數據采用GraphPad Prism 5.0.1科學統計繪圖軟件分析，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間和組內比較均采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 野木瓜注射液對小鼠足趾腫脹的影響

1%角叉菜膠造模后，模型小鼠左后足均明顯紅腫。小鼠組織腫脹程度統計結果如圖1可見，在角叉菜膠注射后，模型組小鼠的足趾腫脹程度相對于造模前持續顯著升高，注射角叉菜膠后48 h，與對照組(100%±3%)相比，模型組(203%±6%)足趾腫脹明顯。可見角叉菜膠皮內注射引發小鼠組織明顯水腫、炎癥反應。注射角叉菜膠后48 h，與模型組相比，野木瓜注射液低、中、高劑量治療組小鼠的足趾腫脹度顯著降低(171%±10%、174%±12%和171%±4%)，表明野木瓜注射液可以有效減輕角叉菜膠誘導的炎癥反應。

Figure 1. Paw edema changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 24 h.

2 小鼠足底熱痛閾值

由圖2可見，皮內注射角叉菜膠后，與對照組(16.1 s±0.6 s)相比，模型組小鼠足底熱痛閾值顯著降低(9.8 s±0.9 s)，在注射后4 h降到最低，表明角叉菜膠注射后，模型組小鼠對熱痛的敏感性明顯升高。注射角叉菜膠后48 h，相對于模型組(11.8 s±1.1 s)，野木瓜注射液低、中、高劑量治療組小鼠的足底熱痛閾值(16.7 s±4.3 s、17.5 s±0.9 s和18.8 s±1.6 s)明顯升高，其中高劑量野木瓜注射液治療組小鼠的足底熱痛閾值恢復到對照組的121%。這表明，野木瓜注射液可以有效抑制角叉菜膠皮內注射引發的痛覺過敏，并且其藥物作用時間持久。

Figure 2. Pain threshold changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 48 h.

3 小鼠背根神經節COX-2表達

小鼠背根神經節COX-2蛋白免疫組織化學染色結果如圖3。在對照組，小鼠L5 DRG細胞中無明顯COX-2蛋白表達。模型組小鼠L5 DRG細胞中COX-2蛋白表達明顯。治療組經過治療后，小鼠L5 DRG細胞中COX-2蛋白表達有所下調。在角叉菜膠注射后12 h、24 h和48 h，模型組小鼠的L5 DRG細胞中的 COX-2表達(323%±18%、324%±24%和342%±15%)較對照組(100%±23%、119%±16%和119%±10%)顯著增加，見圖4。而在注射角叉菜膠后48 h，低、中、高劑量野木瓜注射液治療組小鼠L5 DRG細胞中的COX-2表達(238%±23%、225%±16%和102%±12%)較模型組顯著降低，有劑量依賴性。由此我們推斷，野木瓜注射液可能是通過干預背根神經節中COX-2蛋白表達來抑制炎癥進而阻止疼痛的傳導。

討 論

炎性疼痛是由于創傷、外科手術以及細菌或病毒感染等引發外周組織損傷而導致的炎癥反應，表現為局部的紅、腫、熱、痛與功能障礙，是臨床常見的疾病之一[8]。在炎癥的早期，某些炎癥介質刺激血管，使血管擴張，血管內皮間隙擴大，血管壁通透性增強，血漿內的液體、蛋白質和白細胞等滲出到組織間隙，造成組織腫脹，因此，炎癥滲出、組織腫脹是炎癥早期的重要指標[9]。本研究采用的1%角叉菜膠誘導的小鼠足底疼痛模型可以有效地產生炎性應答。根據形態學結果分析，野木瓜注射液具有抗炎消腫作用。

COX-2與炎癥反應、疼痛信號轉導等密切相關，其在中樞和周邊神經系統的蛋白表達水平因組織損傷和由此產生的炎癥誘導而增加[10]。COX-2表達增加使前列腺素合成增加，后者通過激活環磷酸腺苷和蛋白激酶A通路，加強脊髓疼痛信號以及突觸傳遞，引起外周傷害性神經末梢敏化，炎癥局部出現痛覺過敏[11]。近年的研究表明，通過下調COX-2蛋白表達可阻礙P物質的合成和釋放，進而產生抗炎鎮痛的作用[10]。本實驗中角叉菜膠處理小鼠用藥治療前后足底熱痛閾值對比，顯示野木瓜注射液具有良好的鎮痛作用。同時，COX-2蛋白免疫組織化學染色結果顯示，48 h時，治療組各組小鼠背根神經節COX-2蛋白的表達均低于模型組，并且高劑量野木瓜注射液治療組背根神經節COX-2蛋白的表達降低到正常水平。這些實驗數據顯示，野木瓜注射液可以通過干預COX-2蛋白表達，減輕角叉菜膠引起的炎癥水腫，從而達到抗炎鎮痛的良好效果。

Figure 3. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments by an immunochemical method.Bar=50 μm.

Figure 4. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05, ##P<0.01 vs respective model.

[參 考 文 獻]

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[3] 彭小莉, 高喜玲, 陳 軍, 等. 雞矢藤注射液和野木瓜注射液對大鼠足底皮下化學組織損傷誘致自發痛、痛敏和炎癥的作用[J]. 生理學報, 2003, 55(5):516-524.

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