造影劑腎病發病機制中炎癥反應的探討*

王金艷， 陳 紅， 丁文飛， 鐘愛民

(江西省人民醫院腎內科，江西 南昌 330006)

雖然臨床上使用的造影劑不斷改良，但隨著醫學影像學和介入診療技術的發展，因診療需要造影劑的使用日益增多，造影劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)已成為臨床工作中不可忽視的問題，尤其有心腦血管疾患的高齡患者或有慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)基礎的患者，CIN的發生率更高，除了延長患者住院時間、增加醫療費用外，部分患者會出現不可逆的腎功能丟失，致使患者進入透析期和死亡風險顯著增加[1]。近年來大多數研究主要是針對造影劑導致腎臟內局灶缺血為主的血流動力學改變、氧自由基清除、造影劑本身對腎小管細胞的毒性作用等方面進行了機制方面的研究。CIN的發病中是否存在炎癥反應機制，國內尚無報導，國外這方面的研究新近才見少量報道[2]。本研究著眼于炎癥反應的啟動因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)與核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)在CIN模型動物腎組織中的表達，觀察TNF-α、NF-κB與腎損傷分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)之間的關系，旨在探討CIN發病中是否存在炎癥反應。

材 料 和 方 法

1 動物

SD雄性大鼠96只，體重約為250～350 g，由南昌大學醫學院醫學動物實驗中心提供。

2 主要試劑

兔抗大鼠NF-κB抗體、KIM-1抗體和TNF-α抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SP系列試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)：RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，76%復方泛影葡胺注射液(上海旭東海普藥業有限公司)。

3 主要方法

3.1實驗動物分組 96只雄性SD大鼠，適應性喂養1周后隨機分成2組：對照組(n=48)和模型組(n=48)，分別從尾靜脈注射76%復方泛影葡胺注射液(模型組)和生理鹽水(對照組)10 mL/kg，注射前12 h禁水、禁食。

3.2標本采集 造膜前尾靜脈采血2 mL，分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d和15 d予10%的水合氯醛麻醉大鼠各6只，打開腹腔，留取腹主動脈血液5 mL做生化檢測，后取下雙腎，一側腎臟縱行切開，置于10%甲醛液浸泡固定，待用于病理和免疫組化檢測，另一側腎組織在剪碎以后置于樣本保存液中，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，留做RT-PCR用。

3.3腎小管間質損傷病理評分(HE染色) 取腎組織行常規脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，常規HE染色，觀察腎間質充血、出血，腎小管腫脹、變性、壞死、萎縮，間質炎癥細胞的情況，進行腎臟病理評分。評分標準：腎小管：0分為無腎小管損傷；1分為腎小管損傷范圍<25%；2分為腎小管損傷范圍25%～50%；3分為腎小管損傷范圍51%～75%；4分為腎小管損傷范圍>76%；腎間質：0分為無間質充血、炎癥細胞浸潤；1分為有間質充血；1分為有炎癥細胞浸潤；1分為有纖維化形成。取其均值作為該標本的統計數值。

3.4免疫組化染色 取腎組織行常規脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，免疫組化SP法檢測KIM-1、TNF-α和NF-κB的表達，嚴格按免疫組化SP系列試劑盒說明書操作，光鏡下(×400)觀察組織的陽性表達；并采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件分析陽性目標平均光密度進行半定量分析，取均值做統計比較。

3.5RT-PCR檢測 KIM-1、NF-κB、TNF-α以及內參照引物合成見表1。(1)采用Trizol一步法提取腎臟組織的RNA；(2)RT-PCR反應：按照RT試劑盒說明書操作，所得的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存備用；(3)PCR反應按照試劑盒說明書操作，以所得的cDNA產物2 μL為模板進行聚合酶鏈式反應。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ (KIM-1)、58 ℃(NF-κB)或53 ℃ (TNF-α)退火30 s,72 ℃延伸30 s(35、35或30個循環),最后72 ℃ 10 min；(4)反應結束后，取5 μL的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統及Quantity One凝膠分析系統進行半定量分析，通過計算目的基因PCR產物積分吸光度與β-actin積分吸光度的比值來反映該目的基因mRNA的相對表達量，取均值做統計比較。

表1 引物序列

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，相關關系采用Pearson相關分析，應用統計軟件SPSS 17.0分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 血清肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測

對照組SCr和BUN各時點變化不大(P> 0.05)；CIN模型組SCr和BUN水平造膜后12 h逐漸升高，峰值出現在72 h，顯示造膜成功。除15 d外，模型組SCr和BUN水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠各時點SCr和BUN的比較

2 腎小管損傷評分

對照組各時點大鼠腎臟的腎小管未見明顯損傷，病理評分無顯著差異(P> 0.05)。CIN模型組6 h即見腎小管損傷，24 h和48 h見腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、細胞變性壞死及再生，部分腎小管結構受損，髓質區受損最嚴重，部分腎間質還可見少量炎癥細胞浸潤及纖維化形成，72 h以后腎小管開始逐漸出現修復，15 d基本恢復正常。CIN模型組的腎小管損傷評分顯著高于同一時點的對照組(P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1. Comparison of histopathologic examination in different groups(HE staining, ×400).A：control; B:CIN.

表3 兩組大鼠各時點腎小管間質損傷評分的比較

3 免疫組化染色

KIM-1在造膜后6 h后就開始大量表達，24 h達高峰。NF-κB及TNF-α亦在造膜后6 h后就開始表達，48 h達高峰。除15 d外，模型組KIM-1、NF-κB和TNF-α的表達與對照組對應時點比較均有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

4 RT-PCR結果

建模后腎臟組織各時點KIM-1、NF-κB和TNF-α mRNA表達較對照組顯著升高(P<0.05)，分別在24 h、48 h和48 h達到高峰(P<0.05)，之后又逐漸下降恢復正常水平，見圖3。

5 Pearson相關分析

模型組腎小管損傷評分與腎組織NF-κB、TNF-α蛋白及NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達呈正相關(r=0.843、0.758、0.743和0.707，均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1蛋白表達與NF-κB、TNF-α蛋白表達呈正相關(r=0.863和0.807,均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1 mRNA表達與NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達呈正相關(r=0.839和0.855,均P<0.05)。

討 論

造影劑腎病是臨床不容忽視的問題，但CIN的發病機制尚未完全明了。目前認為CIN的可能發病機制主要有：(1)血流動力學改變導致腎臟缺氧性損傷；(2)造影劑的直接細胞毒性效應，包括造影劑能使尿酸、草酸鹽、Tamm-Horsfll 蛋白等排泄增加，加上脫水導致了腎小管的阻塞[3]；(3)促進細胞凋亡并增加氧自由基損傷等[4]。而對CIN是否存在炎癥機制的研究尚少。

Figure 2. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α at different time points (immunohistochemical staining, ×200).

Figure 3. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α mRNA at different time points.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 h.

1 造影劑對腎臟的損傷

本研究結果顯示，在靜脈注射造影劑后，腎臟病理評分和KIM-1的表達在24 h時為最高峰，而SCr和BUN水平的峰值遲后于腎臟損傷最嚴重時，且KIM-1的表達與腎臟損傷程度同步，考慮SCr和BUN并非腎臟損傷的早期敏感指標，與Vaidya等[5]、Huo等[6]的實驗結果相一致。正常情況下，在人及動物腎組織中幾乎不表達KIM-1，但在腎缺血及腎毒性損傷后的近端小管上皮細胞頂膜高表達[7]，而在腎小球、腎小管周間質細胞或內髓細胞呈低表達[8]。在CIN中，隨著造影劑在腎小管內濃度逐漸增加，造影劑逐漸對腎小管上皮細胞產生直接毒性作用，導致腎小管腫脹、變性、壞死，甚至出現顆粒和空泡變性，特別是腎髓質的髓袢和集合管尤為嚴重，KIM-1大量分泌[9-10]。CIN模型組KIM-1在建模6h后腎小管就開始顯著表達，表達部位位于胞漿，髓質區表達最強烈，在24 h達最高峰，之后逐漸降低恢復正常。實驗結果與上述文獻報告相一致。本研究沒有檢測大鼠尿中的KIM-1，實驗的主要目的在于探討CIN的發病機制，實驗中主要利用KIM-1這一較成熟的生物學標志來觀察和證實腎臟損傷程度，避免腎臟病理評分對腎損傷程度評價的偏差。

2 NF-κB 和TNF-α在CIN腎臟中的表達

NF-κB 廣泛存在于機體各種組織細胞中，參與多種細胞因子和炎癥介質的基因轉錄和級聯放大過程，是公認的啟動炎癥反應瀑布的關鍵因子[11]。通常情況下，在靜止細胞中，組成NF-κB的p50/p65二聚體通常與其抑制因子(IκBα)結合而穩定存在于胞質中。潛伏形式的NF-κB可被多種誘導物如脂多糖、TNF-α等激活，誘導NF-κB活化并迅速進入細胞核，與具有相同序列的各種基因的啟動子/增強子結合，發揮其轉錄調節作用[12]。TNF-α為體內細胞因子調節網絡的啟動因子,是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子，TNF-α可以誘導NF-κB激活，NF-κB活化后可增強TNF-α基因的轉錄，使TNF-α產生和釋放增多，進而再次激活NF-κB產生級聯瀑布效應[13]。張方等[14]的研究也表明NF-κB可正向調控TNF-α的分泌。

我們用免疫組化和RT-PCR實驗方法檢測了對照組和模型組NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA的表達水平，提示模型組在造膜12 h后NF-κB和TNF-α表達就顯著增高，與對照組相比有顯著差異。免疫組化還提示在前期NF-κB的表達主要表達在胞漿中，之后逐漸由胞漿轉入細胞核，在48 h表達最強烈，提示NF-κB誘導特異性基因序列轉錄的能力增強。CIN可誘導IκBα磷酸化，促使NF-κB活化并進入細胞核。TNF-α在建膜12 h后皮質區就開始顯著表達，表達部位位于胞漿，之后陽性區域逐漸向髓質擴大，表達強度也逐漸增強，在48 h達高峰，而之后表達又逐漸降低，15 d少量表達。實驗結果表明，在CIN的發生、發展中，腎臟NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA表達均上調。

3 CIN中炎癥反應機制探討

我們的實驗結果顯示，病理評分、KIM-1的表達與腎NF-κB、TNF-α的表達呈正相關，NF-κB、TNF-α的表達水平與腎損傷程度相一致。它們表達上調意味著炎癥反應的發生和存在。在實驗中，我們還觀察到造膜后24 h、48 h，腎臟病理可見少量的炎癥細胞浸潤及少量纖維化形成，也說明CIN發生與炎癥反應相關。Machado等[2]利用免疫印跡法在CIN大鼠模型中檢測到大量的NF-κB表達，并提出造影劑能誘導IκBα磷酸化作用增強，可加速NF-κB激活并迅速進入細胞核，其研究結果表明降低NF-κB的活性可以減輕CIN炎癥反應和氧化應激損傷。NF-κB和TNF-α在許多腎臟疾病，如狼瘡性腎炎[15]、IgA腎病[16]、 糖尿病腎病[17]、缺血-再灌注性腎損傷[18]、急性腎損傷[19]等的發生、發展過程中起著重要作用。也有研究[20-21]表明抑制TNF-α表達或調控NF-κB通路可以減輕局部或相應疾病的炎癥反應作用。本研究示NF-κB和TNF-α在CIN腎組織中表達上調，說明CIN發病中存在炎癥反應。

造影劑影響腎血流動力學和直接腎小管毒性是CIN的主要發病機制，氧化應激和ROS起了重要的鏈接作用。但炎癥反應在CIN發病中是如氧化應激和ROS一樣起鏈接作用？還是炎癥反應本身就是導致CIN發生的因素？炎癥反應在CIN發病中的作用如何？有效抑制炎癥反應能否阻止CIN的發生和發展？這些問題目前尚不明確，有待進一步研究。

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