兔動脈粥樣硬化血管成形術后再狹窄模型的建立與改良*

曾智桓， 趙艷群， 周萬興， 黃瑞邈， 朱桂平， 肖月瓊

(廣東藥學院附屬第一醫院心內科，廣東 廣州 510080)

經皮冠狀動脈腔內成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)最有效的手段之一，但術后3～6個月內原擴張部位再狹窄率高達30%～50%，明顯限制了經皮冠狀動脈腔內成形術的臨床療效[1]。進一步研究再狹窄的發病機制，有效防治經皮冠狀動脈介入術后再狹窄顯得極為重要。所以首先要建立理想的、合乎臨床多因素致病機制的血管再狹窄動物模型。本研究通過下肢動脈穿刺與球囊損傷、球囊血管成形術結合，成功建立兔動脈粥樣硬化血管成形術后再狹窄模型，方法簡單，成功率高，可重復性強，為臨床研究和治療提供了可靠的疾病模型。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性新西蘭大白兔30只，體質量(1.86±0.65) kg，由廣東省中醫藥大學實驗動物中心提供(動物合格證號為0064167)。按隨機數字表法分為3組，即對照組、下肢動脈穿刺組及下肢動脈切開組。實驗在中山大學實驗動物中心及廣東藥學院附屬第一醫院導管室完成。

2 主要儀器及設備

TERUMO 橈動脈穿刺包(包括穿刺套管針、細超滑鋼絲和6F橈動脈鞘)為日本泰爾茂株式會社生產；碘海醇注射液(歐乃派克350注射液)為通用電氣藥業上海有限公司生產；經皮冠狀動脈腔內成形術球囊FireStar 3.0 mm×20 mm為美國強生公司生產；HITACHI 7180全自動生化分析儀；V5000數字減影X射線機(Philips)；CREALIFE ST-CRS思創科技圖像工作站。

3 模型制備方法

3組家兔均用高脂飼料喂養1周，除對照組外，其它2組家兔均采用氯胺酮(25 mg/kg)+地西泮(0.11 mg/kg)腿部肌肉注射麻醉，仰臥位固定，下肢備皮。下肢動脈穿刺組采用TERUMO橈動脈穿刺包穿透法穿刺股動脈成功后輕柔地進入導絲，沿導引鋼絲插入6F橈動脈鞘管，300 U肝素抗凝，在數字減影X射線機下，經動脈鞘管注入碘海醇注射液行動脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經皮冠狀動脈腔內成形術球囊至髂動脈，用303.975 kPa充盈球囊，在髂動脈上下牽拉3次，充分剝離髂動脈內皮。傷口紗布卷加壓包扎。下肢動脈切開組，在右大腿中部沿股動脈走行切開皮膚，分離皮下組織及右側股動脈，結扎動脈遠端，阻斷動脈近端，縱行切開動脈壁，插入TERUMO橈動脈鞘，300 U 肝素抗凝，經動脈鞘管注入碘海醇注射液行動脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm經皮冠狀動脈腔內成形術球囊至髂動脈，用303.975 kPa充盈球囊，在髂動脈上下牽拉3次，充分剝離髂動脈內皮。拔出鞘管，結扎動脈近端。縫合傷口皮膚，無菌敷料覆蓋。2組均肌肉注射青霉素鈉(8.0×105U/d)×3 d。3組動物繼續高脂飼養4周。

高脂飼養4周后，下肢動脈穿刺組及下肢動脈切開組的家兔再次采用上述方法麻醉、固定。下肢動脈穿刺組下肢備皮，采用TERUMO橈動脈穿刺包穿透法穿刺股動脈成功后輕柔地進入導絲，沿導引鋼絲插入6F橈動脈鞘管，300 U肝素抗凝，在數字減影X射線機下，經動脈鞘管注入碘海醇注射液行動脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經皮冠狀動脈腔內成形術球囊至髂動脈損傷處，用607.95 kPa充盈球囊擴張髂動脈損傷處，每次擴張30 s，擴張3次。下肢動脈切開組右頸動脈區域備皮，沿頸動脈走行切開皮膚，分離皮下組織及右側頸動脈，結扎動脈遠端，阻斷動脈近端，縱行切開動脈壁，插入TERUMO橈動脈鞘，300 U 肝素抗凝，經動脈鞘管注入碘海醇注射液行動脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經皮冠狀動脈腔內成形術球囊至右髂動脈，用607.95 kPa充盈球囊擴張髂動脈損傷處，每次擴張30 s，擴張3次。3組動物均改為普通飼料喂養4周。最后再采用上述方法麻醉、固定及穿刺股動脈造影，采動脈血檢測血脂，取髂動脈。

4 觀察指標及方法

各組血清標本均采用HITACHI 7180全自動生化分析儀測定血清低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和三酰甘油濃度。髂動脈標本取材后立即用體積分數4%甲醛溶液固定1 d后脫水，石蠟包埋，連續病理切片2張(厚4.0～5.0 μm)，行蘇木精-伊紅和免疫組化染色。各組造影結果采用CREALIFE ST-CRS思創科技圖像工作站進行血管狹窄分析。

5 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件包對數據進行統計分析，各組計量資料數據用均數±標準差(mean±SD)表示。實驗數據先行正態性檢驗和方差齊性檢驗；兩組均數比較用t檢驗;兩組以上均數比較在方差齊時用單因素方差分析，方差不齊時用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 動物一般情況

下肢動脈切開組1只實驗兔第2次實驗術后1周因感染、腹瀉死亡，對照組及動脈穿刺組均順利完成實驗進入結果分析，成功率100%。所有實驗兔均未見肢體缺血壞死，但下肢動脈切開組右下肢動脈結扎術后行動明顯遲緩，進食量下降，精神狀態差。

2 3組家兔的血脂水平比較

血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇在動脈切開組均較動脈穿刺組及模型對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇在3組間無顯著差別(P>0.05)。

表1 血清三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇的檢測結果

3 病理學檢測結果

對照組可見粥樣斑塊，動脈壁及內膜略增厚，中膜平滑肌少量泡沫細胞及炎性細胞形成(圖1A)；動脈穿刺組(圖1B)及動脈切開組(圖1C)均可見明顯粥樣斑塊，動脈壁增厚，管腔狹窄，層次不清，內膜增厚，中膜平滑肌增生紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，形成典型的“纖維帽”結構，尤其是動脈穿刺組，部分斑塊內出現鈣化或大量纖維化。

Figure 1. Iliac artery in the rabbits with different treatments (hematoxylin-eosin staining, ×100).A:control group; B:arterial puncture group; C:limb artery incision group.

4 血管造影血管狹窄分析

與對照組相比，動脈穿刺組與動脈切開組均形成顯著血管再狹窄，見圖2。與對照組相比，動脈穿刺組與動脈切開組血管面積狹窄率及直徑狹窄率均有顯著差異(P<0.01)；動脈穿刺組面積狹窄率及直徑狹窄率均較動脈切開組稍高，但尚未達統計學差異，可能與樣本量較小有關,見表2。

Figure 2. Iliac artery stenosis in the rabbits with different treatments (angiography, ×3).A:control group; B: arterial puncture group; C:limb artery incision group.

表2 對照組、動脈穿刺組和動脈切開組家兔髂動脈再狹窄的比較

討 論

如何建立有效的血管再狹窄模型對開展血管成形術后再狹窄(restenosis after angioplasty)的研究非常重要[2]。國內外用于血管再狹窄研究的動物模型的建立方法眾多，主要選擇的動物有大鼠、兔、豬、犬等，選取的手術部位也多種多樣[3]。新西蘭兔建模穩定，成本較低，為最常用的實驗動物[4]。兔的髂動脈管腔大小更接近人的冠狀動脈再狹窄, 故本實驗選用該動脈。

兔血管再狹窄模型建模方法多采用切開、結扎股動脈或頸動脈，球囊損傷加高脂喂養，在此基礎上行球囊擴張建立再狹窄模型，由于切開、動脈結扎的技術問題，以及時常造成傷口感染，動物肢體缺血，活動能力差，進食少，經常發生實驗動物死亡情況[5]。本實驗切開組出現1只動物死亡，進食量明顯下降，最后化驗血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇較對照組低，也證實了這一點。而采用經皮動脈穿刺，術后局部加壓包扎止血即可，無明顯手術傷口，有利于實驗動物術后的恢復。

傳統的兔動脈粥樣硬化及再狹窄模型均采用切開后結扎方法，動脈結扎后形成盲端，血流顯著減慢，部分可能無血流，與臨床所見再狹窄形成過程中血流動力學不一致，造成血管內膜增生和血管向內重塑反應不同，可導致實驗結果偏差[6]。

目前尚沒有關于經皮穿刺兔血管制作血管再狹窄模型的研究報道。本實驗通過多次穿刺兔股動脈，對兔髂動脈進行球囊損傷，建立兔血管狹窄的病理模型，再對病變血管進行球囊擴張成形術，形成再狹窄模型，可對血管再狹窄疾病發生發展的過程進行動態觀察和評價。但經皮穿刺兔股動脈要求術者要有良好的血管穿刺基礎，在日常工作中如果能熟練地進行橈動脈穿刺者，穿刺成功率將大大提高。建議使用套管針穿刺，盡可能一次穿刺成功，否則局部血腫將嚴重影響再次穿刺。一旦發生，可局部壓迫止血，選擇對側股動脈穿刺。本實驗充分證實了多次兔股動脈經皮穿刺的可行性，無需反復結扎動脈，為兔血管成形術后再狹窄提供了新的研究方法。

本文為動物實驗，動脈粥樣硬化形成迅速，與人類的冠狀動脈血管成形術后再狹窄仍存在一定的差異。但由于本實驗方法有模型穩定可靠、易于復制、成功率高等優點，而且證實了在血管再狹窄機制方面均存在血管內膜增生、平滑肌細胞增殖、炎癥細胞浸潤、斑塊內部鈣化或大量纖維化等機制，與臨床再狹窄相似，是血管成形術后再狹窄研究中較理想的動物模型，值得進一步研究。

[參 考 文 獻]

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[3] Touchard AG, Schwartz RS.Preclinical restenosis models: challenges and successes[J]. Toxicol Pathol, 2006, 34(1):11-18.

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