青蒿組分的體外抗氧化活性研究

馬文芳+郭新榮+余秀+李晉+王春鵬+王振中+成志東+常艷旭+蕭偉

[摘要] 目的 研究青蒿水提取物抗氧化活性及物質基礎，為天然抗氧化劑開發利用提供理論依據。 方法 采用傳統加熱回流提取法，用水作為提取溶劑對青蒿中抗氧化成分進行提取，并利用溶劑萃取、D101大孔樹脂等分離手段對水提取物進行組分劃分，進行DPPH自由基清除活性評價及鐵離子還原能力、亞鐵離子螯合能力、總酚酸和總黃酮的測定。 結果 從青蒿水提取物中制備得到11個組分，且70%乙醇洗脫液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、大孔樹脂20%乙醇洗脫液（S9）的抗氧化活性較高，與其所含的總酚酸和總黃酮密切相關。 結論 本研究明確了青蒿中大孔樹脂70%乙醇洗脫液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、大孔樹脂20%乙醇洗脫液（S9）為青蒿水提取物抗氧化活性物質基礎，為今后青蒿資源在天然抗氧化劑的開發和應用奠定基礎。

[關鍵詞] 青蒿；抗氧化活性；DPPH法；總黃酮；總酚酸

[中圖分類號] R646[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）05（b）-0004-05

Study on antioxidant of Artemisia annua L. Fraction in vitro

MA Wenfang1 GUO Xinrong1 YU Xiu1 LI Jin1 WANG Chunpeng1 WANG Zhenzhong2 CHENG Zhidong2CHANG Yanxu1,2 XIAO Wei2

1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese MedicineTianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2.Postdoctoral Workstation, Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangsu Province, Lianyungang222001, China

[Abstract] Objective To screen antioxidant from the water extracts of A. annua L. for providing the theoretical basis for the development and application of natural antioxidants. Methods A. annua L.were extracted with water by conventional heating reflux extraction. Water extracts were separated by means of solvent extraction, D101 macroporous resin. The radical scavenging activity of fractions was evaluated by DPPH, reducing power and metal chelating capacity assay. Total phenolic and total flavonoids of antioxidant fractions were determinated. Results 11 fractions were obtained from A. annua L. Antioxidant activity of 70% ethanol eluate from macroporous resin (S10), ethyl acetate extract (S6), 20% ethanol eluate from macroporous resin (S9) fractions was higher and was highly correlated with total phenolic and total flavonoid content. Conclusion It is demonstrated that 70% ethanol eluate from macroporous resin (S10), ethyl acetate extract (S6), 20% ethanol eluate from macroporous resin (S9) are material basis for antioxidant activity of water extract from A. annua L., which can lay the foundation for resources of A. annua L. in the development and application of natural antioxidants

[Key words] Artemisia annua L.; Antioxidant activity; DPPH assay; Total phenolic acids; Total flavonoid

隨著自由基生物學深入發展，人們逐漸認識到，自由基會對人體的產生一定的負面影響，而適當補充外源性抗氧化劑或給予能促使機體內源性抗氧化物質恢復到一定水平的藥物，可以改善這一狀況[1]。抗氧化劑是指在低濃度下能有效延緩或阻止底物（蛋白質、脂質、糖和DNA）氧化的物質[2]。目前抗氧化劑依據其來源可分為兩大類：化學合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。現代研究表明化學合成的抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）、沒食子酸丙酯（PG）和特丁基對苯二酚（TBHQ）具有一定的毒性和致癌作用，其應用范圍受到一定的限制，而天然抗氧化劑因其具有無毒副作用、無殘留、無污染、穩定、安全等優點，符合人們對健康、安全新需求，而越來越受到人們的關注。天然抗氧化劑的研究在醫藥學、保健與功能食品、美容養顏護膚等領域均有非常重要的意義[3]。

現代研究表明某些中藥具有明顯的抗氧化活性，并與其所含各種各樣的天然產物，如酚酸、黃酮類化合物和丹寧酸等密切相關。近年來，中藥的抗氧化活性受到研究者的關注，取得了許多研究成果[4-6]。因此，中藥資源可作為高效的天然抗氧化劑篩選的一個重要來源。

青蒿（黃花蒿，Artemisia annua L.）為菊科蒿屬（Arte misia）一年生草本植物[7]。味苦，性寒而芳香，入肝、膽經。本品苦寒以清熱，芳香而透散，長于清泄肝膽和血分之熱，可使陰分伏熱由陰分透出陽分。常用治暑邪發熱、溫邪傷陰發熱、瘧疾寒熱、骨蒸勞熱以及血分有熱的風疹瘙癢等癥[8]。

目前對青蒿中抗氧化活性的研究不多，僅有少量文獻對青蒿中水提取物、黃酮類化合物的抗氧化進行報道，而有關青蒿中的抗氧化活性物質基礎的未見報道。本研究擬根據青蒿的傳統提取方法，利用溶劑萃取、D101大孔樹脂等分離手段對水提取物進行組分劃分，并進行DPPH自由基清除活性評價，明確青蒿抗氧化活性組分，擬為從青蒿篩選天然抗氧化劑提供實驗參考依據，為今后青蒿資源在天然抗氧化劑的開發和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

RE-5205/RE-52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；TDL-5-B型臺式低速離心機（湖南星科科學儀器有限公司）；電熱真空干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）；BP121S萬分之一天平（德國賽托利斯公司）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MODEL2-16A高速離心機（TOMOS）；202-0型臺式干燥箱（北京市永光明醫療儀器廠）；多功能微孔板分析儀（美國Molecular Devices 公司）。

1.1.2 試劑與藥材

1.1.2.1 試劑D101型大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；甲醇，乙腈為色譜純（天津康科德有限公司）；蘆丁，沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所）；DPPH（Sigma-aldrich）；甲酸（TEDIA Company，USA）水為超純水（Millipone），其余試劑均為分析純。

1.1.2.2 藥材青蒿（江蘇康源股份有限公司青蒿基地）。

1.2 實驗方法

1.2.1 青蒿組分的制備

稱取青蒿飲片0.5 kg，置于10 L圓底燒瓶中，加6 L蒸餾水，浸泡12 h，加熱回流2 h，濾過，剩余殘渣加入4 L蒸餾水，加熱回流2 h，濾過，合并濾液，60℃減壓濃縮至700 mL，取50 mL母液作為S1，剩余母液70%醇沉，靜置12 h。醇沉溶液14 000 r/min，離心10 min，得沉淀S2和上清液，上清液于60℃減壓濃縮至400 mL，取50 mL作為S3。剩余溶液用等體積石油醚萃取，得石油醚萃取物S4，取剩余溶液50 mL作為S5，然后剩余溶液用等體積乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物S6，取剩余溶液50 mL作為S6。過D101大孔樹脂，分別用兩個柱體積的蒸餾水，20%乙醇，70%乙醇，95%乙醇進行洗脫，得S8~S11。將S8~S11置于水浴鍋上揮干，然后放入60℃真空干燥箱中干燥約8 h，至恒重取出，稱量。

1.2.2 青蒿組分清除DPPH自由基活性研究

二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一種穩定的以氮為中心的自由基，在517 nm波長處有最大吸收。[DPPH·]醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關系。在[DPPH·]乙醇溶液中加入樣品后，樣品可以與[DPPH·]結合或發生替代，使[DPPH·]數量減少，溶液顏色變淺，表現為：其在517 nm波長處的吸光度不斷減小，直至達到穩定[9]。清除率計算公式為：K=[1-（A1-A2）/Ao]×100%，其中Ao為空白對照液的吸光度，A1為加入待測液后的吸光度，A2為待測液的本底吸收值。抗氧化劑清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率（IC50值）表示[10-11]。所需濃度越低，表明半清除率越高，抗氧化劑的自由基清除能力越強。本實驗用比色法測定青蒿各組分的總體抗氧化能力，以VC、VE為陽性對照藥物，平行測定3次，取平均值。

稱取適量青蒿組分S1~S11和VC、VE用適宜溶劑溶解配制成1 mg/mL后，按一定濃度配制后，分別取400 μL放于eppendorf管中，加入400 μL的100 μg/mL DPPH，渦旋30 s，在室溫下放置30 min后，吸取200 μL于96孔板。每個濃度平行制備3份，于微型多功能酶標儀517 nm下測定，VC和VE作為陽性對照[12]，并以VC、VE的濃度（X）為橫坐標，抑制率（Y）為縱坐標，繪制VC、VE的標準曲線，計算回歸方程，利用回歸方程求出供試品溶液中折合VC、VE的濃度（總抗氧化活性），并計算青蒿組分中總抗氧化活性的含量。每個樣品平行制備3份，每次平行測定3個復孔，取平均值。其中總抗氧化活性的含量包括相對總抗氧化活性的含量和絕對總抗氧化活性的含量。

青蒿組分抗氧化劑含量（mg/g）=CD/W，其中W為青蒿組分S1～S11的重量（g），C為供試品溶液中折合VC、VE的濃度（mg/mL），D為稀釋因素。青蒿組分等價于原藥材的抗氧化劑總量（mg/kg）=CDE/W，其中W為青蒿組分S1～S11的重量（kg），C為供試品溶液中折合VC、VE的濃度（mg/mL），D為稀釋因素，E為產率。

1.2.3青蒿組分鐵離子還原能力評價

精密稱取各樣品1 mg，加入甲醇和水混合溶劑溶解，分別取0.2 mL樣品溶液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6），和1 mL鐵氰化鉀（1%，W/V），混合均勻后在50℃水浴放置20 min，加入1 mL三氯乙酸（10%，W/V）混合后，取上清液1 mL加入1 mL水，加入0.2 mL的氯化鐵溶液（0.1%，W/V），30 min后，在700 nm下紫外檢測，以沒食子酸值計算。

1.2.4 青蒿組分亞鐵離子螯合能力評價

1 mL FeSO4（0.025 mmol/L）加入不同稀釋倍數的樣品溶液1 mL，接著加入1 mL Ferrozine（0.25 mmol/L），10 min后在562 nm下紫外檢測，以甲醇-水溶劑代替樣品為對照。螯合效率=（1-Asample/Acontrol）×100，以EC50（CEC50）表達。

1.2.5 青蒿提取物總酚酸和總黃酮的含量測定

1.2.5.1 青蒿提取物總酚酸的含量測定分別精密吸取不同體積的沒食子酸對照品溶液，用甲醇稀釋到200、100、50、20、10、5、1 μg/mL，分別取對照品溶液100 μL加入500 μL FCR（1∶10，V/V），渦旋30 s，加入400 μL的Na2CO3（7.5%，M/V），30℃反應90 min后，吸取200 μL于96孔板中。每個濃度平行制備3份，于微型多功能酶標儀765 nm下測定，以待測液的本底溶液為空白對照[13]。以對照品的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制沒食子酸的標準曲線，計算回歸方程。

分別取100 μL供試品溶液加入500 μL FCR （1℃10，V/V），渦旋30 s，接著加入400 μL Na2CO3 （7.5%，M/V），30℃反應90 min后，吸取200 μL于96孔板中，每個樣品平行制備3份，每次平行測定3個復孔，取平均值。按沒食子酸標準曲線制作方法測定其吸光度，利用回歸方程求出供試品溶液中折合沒食子酸的濃度（總酚酸），并計算青蒿組分中總酚酸的含量。計算公式：總酚酸含量（%）=CD/W×100%，其中W為青蒿組分S1~S11的重量（g），C為供試品溶液中折合沒食子酸的濃度（mg/mL），D為稀釋因素。

1.2.5.2 青蒿提取物總黃酮的含量測定分別精密吸取不同體積的蘆丁對照品溶液，用甲醇稀釋成80、70、60、50、40、30、20、10、5 μg/mL。分別取1 mL于eppendorf管中，加入100 μL的NaNO2（5%），靜置6 min后，加入100 μL的AlCl3（10%），靜置6 min，然后加入1 L的NaOH（5%），混合均勻，吸取200 μL于96孔板中，每個濃度平行制備3份。用微型多功能酶標儀全波長掃描，于415 nm下測定，以待測液的本底溶液為空白對照[14]。以對照品的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制蘆丁的標準曲線，計算回歸方程。

精密稱取青蒿組分S1～S11，用適宜溶劑溶解配制成1 mg/mL（S4，S6組分樣品用甲醇溶解，其余組分樣品用40%甲醇溶解），作為供試品溶液。分別取500 μL，加入50 μL的NaNO2（5%），靜置6 min后，加入50 μL的AlCl3（10%），靜置6 min，然后加入500 μL的NaOH（5%），混合均勻，吸取200 μL于96孔板中，每個樣品平行制備3份，每次平行測定3個復孔，取平均值。按蘆丁標準曲線制作方法測定其吸光度，利用回歸方程求出供試品溶液中折合蘆丁的濃度（總黃酮），并計算青蒿組分中總黃酮的含量。計算公式：總黃酮含量（%）=CD/W×100%，其中W為青蒿組分S1～S11的重量（g），C為供試品溶液中折合黃酮的濃度（mg/mL），D為稀釋因素。

2 結果

2.1 青蒿組分的得率

通過提取分離所得的S1～S11個組分的產率分別為20.16%、4.12%、15.33%、0.14%、14.00%、1.25%、12.29%、8.51% 1.02%、1.96%和0.02%。

2.2 青蒿組分抗氧化活性比較研究

2.2.1 青蒿組分清除DPPH自由基的能力比較研究

采用DPPH法對青蒿不同組分進行了測定，結果顯示各組分均具有一定的抗氧化作用。以VC和VE作為陽性對照，IC50為指標，對不同青蒿組分的抗氧化活性進行比較研究（表1）。結果發現：11個組分清除DPPH自由基能力排序為：S10>S6>S9>S1>S3>S2>S11>S7>S5>S8>S4；當以IC50≤100 μg/mL為臨界值，所制備的組分S6[（72.40±1.11）μg/mL]、S9[（84.85±0.50）μg/mL]和S10[（58.37±0.85）μg/mL]具有較強的抗氧化活性，但均低于陽性對照物VC、VE。

表1 青蒿組分與VC、VE的IC50值（μg/mL，x±s，n=3）

2.2.2 青蒿組分抗氧化活性物質含量比較研究

本研究以VC、VE為陽性對照藥物，建立了量效關系曲線，結果發現在1～13 μg/mL、15～45 μg/mL范圍，VC、VE的濃度與各自抑制率呈良好的線性關系，回歸方程分別為Y=4.525X-6.299（r=0.996），Y=1.500X-0.137（r=0.999）。根據各組分的抑制率，以等價的VC、VE的量為指標，對其所含抗氧化劑含量進行了測定結果見表2。從表2可知1 g S6、S9和S10提取物分別等價于（144.92±2.60）、（111.32±0.33）、（163.91±4.20）mg的VC，相當于（515.19±7.83）、（389.44±1.00）和（580.27±12.70）mg的VE，因此青蒿組分S6、S9和S10具有較好的抗氧化活性，可用于進一步天然抗氧化劑篩選。

表2 青蒿組分中抗氧化活性物質的含量（mg/g，x±s）

2.3 青蒿組分鐵離子還原能力的評價

不同濃度的青蒿組分鐵離子還原能力評價結果見表3，S10、S9和S6具有較強的還原能力，其中組分S10和S6的活性優于人工合成的抗氧化劑二丁基羥基甲苯（BHT）的活性。

表3 青蒿組分還原能力（x±s，n=3）

2.4 青蒿組分亞鐵離子螯合能力

以VC作為陽性對照，IC50為指標，對不同青蒿組分的亞鐵離子螯合能力進行比較研究（表4）。表4發現：10個組分亞鐵離子螯合能力排序為：S2>S8>S1>S7>S9>S4>S3>S10>S5>S6>S4；當以IC50≤1000 μg/mL為臨界值，所制備的組分S2、S1和S8具有較強的亞鐵離子螯合能力，但均高于陽性對照物Vc。

表4 青蒿組分的亞鐵離子螯合能力（μg/mL，x±s，n=3）

2.5 青蒿組分抗氧化活性相關物質研究

近年來的研究表明，植物抗氧化活性與植物中所含酚酸類和黃酮類化合物密切相關，為了闡明青蒿發揮抗氧化活性物質基礎，本研究選用福林試劑法測定總酚酸含量，三氯化鋁比色法測定總黃酮含量。

2.5.1 總酚酸含量測定

本研究以沒食子酸為陽性對照，建立了沒食子酸的標準曲線，結果表明在1～200 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.0016x-0.0005（r=0.999）。

利用福林試劑法對S1～S11的總酚酸含量進行了測定（表5），結果表明11個組分中中均含有一定量的酚酸，其中S10[（90.51±0.02）mg/g]、S6[（83.47±0.60）mg/g]和S9[（81.81±0.80）mg/g]的酚酸含量最高，與其抗氧化活性IC50具有較好的相關性。

2.5.2總黃酮測定

本研究以蘆丁為陽性對照，建立了蘆丁的標準曲線，結果表明在1～80 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.0062x-0.0108（r=0.999）。利用三氯化鋁比色法對S1～S11的總黃酮含量進行了測定（表5），結果表明11個組分中中均含有一定量的黃酮，其中S10[（73.72±0.77）mg/g]、S6[（53.85±0.30）mg/g]和S9[（69.76±1.13）mg/g]的總黃酮含量最高，并與其抗氧化活性IC50具有較好的相關性。

表5 青蒿中11個組分的總酚酸含量和總黃酮含量（mg/g，x±s，n=3）

上述研究表明，青蒿各組分具有抗氧化活性，其中組分S10、S6和S9抗氧化活性最強，其發揮抗氧化的物質基礎可能是其酚酸和黃酮類化合物。

3 討論

從青蒿水提取物中制備得到11個組分，利用DPPH法、還原能力法與亞鐵離子螯合法對青蒿組分的抗氧化活性進行測定，且使用福林試劑法與三氯化鋁比色法對其總酚酸和總黃酮進行了定量研究，發現了青蒿中70%乙醇大孔樹脂洗脫液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、20%乙醇大孔樹脂洗脫液（S9）具有較強的抗氧化活性。青蒿不同組分抗氧化能力的強弱與總酚酸和總黃酮的含量有明顯相關性，說明酚酸和黃酮可能是主要的活性物質；青蒿水溶液（S1），青蒿多糖組分（S2）和大孔樹脂水洗脫物（S8）具有較強的亞鐵離子螯合能力，在亞鐵離子的螯合能力方面卻顯著高于其他組分。本研究制備了青蒿不同標準組分，結合此多種方法對青蒿組分的抗氧化活性進行了較為全面的評價，初步闡明了各組分的抗氧化活性，為青蒿作為天然抗氧化劑資源開發利用提供科學依據。

[參考文獻]

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[10]鄭德勇.竹葉提取物清除DPPH自由基的測定方法[J].福建農林大學學報，2005，34（1）：59.

[11]Mirella N，Gaulejac N. Comparative study of polyphenol scavenging activities assessed by different methods [J]. J Agric Food Chem，1999，47（2）：425-431.

[12]Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical [J]. Nature，1958，（181）：1199-1200.

[13]Mohammad A，Esmaeili AS. Antioxidant，free radical scavenging activities of Salvia brachyantha and its protective effect against oxidative cardiac cell injury [J]. Food and Che mical Toxicology，2010，（48）：846-853.

[14]祝德秋，羅啟劍，崔嵐，等.連錢草-小薊混合粉中總黃酮的含量測定[J].華西藥學雜志，2003，18（6）：477-478.

（收稿日期：2014-01-26本文編輯：衛軻）

[基金項目] 國家科技重大專項課題（編號2010ZX09502-005）；中國博士后科學基金資助項目（編號2012T50225）。

[作者簡介] 馬文芳（1988-），女，天津中醫藥大學2011級中藥學專業在讀碩士研究生，從事中藥藥效物質基礎研究。

[通訊作者] 常艷旭（1981.12-），男，博士，副研究員，主要從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究。蕭偉，博士，研究員，高級工程師，從事中藥新劑型的研究與開發。

·編讀往來·

正文主體部分之“討論”

1.著重討論研究結果的創新之處及從中導出的結論，包括理論意義、實際應用價值、局限性，及其對進一步研究的啟示等。如果不能導出結論，也可通過討論，提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。

2.應將本研究結果與其他有關的研究相比較，并將本研究結論與目的聯系起來討論。

3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結果部分詳述過的數據或資料。不應列入圖或表。

[4]樸香淑，樸香蘭，洪承權.中藥連翹體外抗氧化作用的研究[J].中央民族大學學報：自然科學，2008，17（1）：77-81.

[5]彭偉文，洪暉菁.幾味姜科和豆科類中藥抗氧化性能的研究[J].時珍國藥研究，1998，9（2）：146.

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[14]祝德秋，羅啟劍，崔嵐，等.連錢草-小薊混合粉中總黃酮的含量測定[J].華西藥學雜志，2003，18（6）：477-478.

（收稿日期：2014-01-26本文編輯：衛軻）

[基金項目] 國家科技重大專項課題（編號2010ZX09502-005）；中國博士后科學基金資助項目（編號2012T50225）。

[作者簡介] 馬文芳（1988-），女，天津中醫藥大學2011級中藥學專業在讀碩士研究生，從事中藥藥效物質基礎研究。

[通訊作者] 常艷旭（1981.12-），男，博士，副研究員，主要從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究。蕭偉，博士，研究員，高級工程師，從事中藥新劑型的研究與開發。

·編讀往來·

正文主體部分之“討論”

1.著重討論研究結果的創新之處及從中導出的結論，包括理論意義、實際應用價值、局限性，及其對進一步研究的啟示等。如果不能導出結論，也可通過討論，提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。

2.應將本研究結果與其他有關的研究相比較，并將本研究結論與目的聯系起來討論。

3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結果部分詳述過的數據或資料。不應列入圖或表。

[4]樸香淑，樸香蘭，洪承權.中藥連翹體外抗氧化作用的研究[J].中央民族大學學報：自然科學，2008，17（1）：77-81.

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（收稿日期：2014-01-26本文編輯：衛軻）

[基金項目] 國家科技重大專項課題（編號2010ZX09502-005）；中國博士后科學基金資助項目（編號2012T50225）。

[作者簡介] 馬文芳（1988-），女，天津中醫藥大學2011級中藥學專業在讀碩士研究生，從事中藥藥效物質基礎研究。

[通訊作者] 常艷旭（1981.12-），男，博士，副研究員，主要從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究。蕭偉，博士，研究員，高級工程師，從事中藥新劑型的研究與開發。

·編讀往來·

正文主體部分之“討論”

1.著重討論研究結果的創新之處及從中導出的結論，包括理論意義、實際應用價值、局限性，及其對進一步研究的啟示等。如果不能導出結論，也可通過討論，提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。

2.應將本研究結果與其他有關的研究相比較，并將本研究結論與目的聯系起來討論。

3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結果部分詳述過的數據或資料。不應列入圖或表。