應重視介入呼吸病學的快速現場評價*

馮 靖 陳寶元 吳 琦

述評

應重視介入呼吸病學的快速現場評價*

馮 靖1陳寶元1吳 琦2

介入呼吸病學的快速現場評價（ROSE）包括快速現場細胞學評價（C-ROSE）和快速現場微生物學評價（M-ROSE）兩大部分。該技術在近年來逐漸成為現代介入呼吸病學的核心技術之一。本文就ROSE技術的起源和發展、分類和臨床價值、基本操作方式、臨床應用情況以及如何卓有成效地開展ROSE工作做相關述評。

快速現場評價；介入呼吸病學；細胞學；微生物學；病理學

快速現場評價（rapid on site evaluation，ROSE）技術歷史悠久，但在過去相當長一段時間內并未得到廣泛開展。由于各類介入與微創技術快速崛起，加之快速染色制片技術的進步，ROSE技術的價值與優勢變得愈加凸顯，正在臨床中發揮越來越積極的作用。

1 現代ROSE技術的起源和發展

2005年左右，經氣管鏡針吸活檢（TBNA）、經氣管鏡細針吸引細胞學檢查（FNA）與針吸脫落細胞學檢查等介入呼吸病學技術大量開展。這些檢查具備良好的敏感性和特異性，不僅廣泛用于呼吸系統惡性疾病的診斷，在如結節病、肺結核等良性呼吸系統疾病的診斷中也有較大臨床意義。如果通過這些檢查能夠得到合適的標本，則無需進行如縱隔鏡、電視輔助胸腔鏡以及開胸活檢等創傷性較大的檢查[1]。但在這些檢查中，如何判斷是否得到了標本，得到的標本量是否足夠和合適，標本如何進一步處理，甚至如何立即獲得初步診斷等問題就擺在了介入呼吸病學專家面前。顯然，這些實時信息的作用是不可估量的。在實際操作中，如果得到了合適標本，操作即應立即終止，可以節省時間并減少患者創傷和并發癥的發生。相反，如果沒能得到標本，操作應繼續進行并同時改變操作的方式方法。而且，如能立即獲得初步診斷，不僅能為臨床醫師提供重要參考，還可以做進一步操作和適當處理，以幫助進行特殊輔助檢查如電子顯微鏡、免疫組織化學、染色體熒光原位雜交（FISH）、聚合酶鏈反應（PCR）以及微生物學相關檢查，從而使得整個操作近乎完美。正因如此，各種類型的ROSE技術在歐美得以廣泛使用[2-3]。由于ROSE技術（本文中特指呼吸ROSE技術）具有獲得結果極快和可重復次數極高的優勢，使得其在介入呼吸病學和呼吸危重癥的治療方面具有較大的臨床意義。

有關現代ROSE的系統研究和系統meta分析始于1993年，Austin等[4]對55例懷疑患有肺癌的患者進行了細針穿刺針吸活檢，結果有ROSE指導的操作其陽性率為100%，而沒有ROSE指導的操作其陽性率僅有80%，該研究證實ROSE可以提高手術操作的陽性率并減少無謂的手術操作，從而減少操作相關并發癥。

近年來，介入呼吸病學快速發展，一批新技術應用于臨床。主要包括：X線定位支氣管鏡技術、經支氣管鏡超聲技術、電子導航超細支氣管鏡技術、電磁導航支氣管鏡技術、三維仿真支氣管鏡技術等，加之肺部外科手術技術的進步以及呼吸危重癥治療中對微生物病原學的急切要求，對ROSE技術提出了許多更高的要求。

2 ROSE技術的分類和臨床價值

ROSE工作者可以是有專門經驗的病理學專家，也可以是呼吸介入中心的技術人員、護士、實習研究生，甚至是直接參與介入操作的臨床醫師。呼吸ROSE技術主要包括兩大部分：快速現場細胞學評價（cytological ROSE，C-ROSE）和快速現場微生物學評價（microbiological ROSE，M-ROSE）。這兩部分缺一不可，相輔相成，構成了呼吸ROSE技術的完整輪廓。

C-ROSE的主要臨床意義包括：（1）指導介入呼吸病學診斷的進度。如指導經氣管鏡黏膜活檢、經氣管鏡深部肺活檢（TBLB）、經氣管鏡深部刷檢、TBNA、FNA、經氣管鏡支氣管肺泡灌洗（BALF）、經皮肺活檢、經皮胸膜活檢、經胸腔鏡胸膜活檢，以及其他部位（如皮下或深在部位）針吸脫落細胞學檢查。（2）指導介入呼吸病學治療的進度及判斷介入呼吸病學治療的效果。如指導各類經氣管鏡消融治療（高頻電刀、氬等離子電凝、冷凍切除、光動力治療、經氣管鏡微波治療、經氣管鏡激光治療等）。（3）經氣管鏡確定肺部腫瘤外科手術切除線。（4）指導中心性肺癌患者的診斷及治療后隨訪。MROSE的主要臨床意義包括：（1）可以提供部分微生物病原的形態學依據。如念珠菌屬的屬間鑒別，曲霉菌屬的屬間鑒別，耶氏肺孢子菌、其他類型真菌、球菌和桿菌的形態學，中性粒細胞球菌和桿菌的細菌吞噬現象。（2）可以有極高的重復檢查次數。（3）由于可以提供細胞分類與計數及其比例等細胞學背景，因此可以進行病情的估計和療效的預判。

3 ROSE技術的基本操作方式

ROSE在實際操作中主要是用普通光學顯微鏡或熒光顯微鏡對于采集到標本的玻片進行立即觀察判讀并獲得結果。所以，ROSE操作實際上由制片、染色和觀察3部分構成。由于對時間的要求嚴格，ROSE操作的核心是如何提高制片和染色的速度。ROSE快速制片方式主要有：（1）小外檢組織塊滾片（印片）法。用于多數經氣管鏡或胸腔鏡黏膜活檢與肺活檢，經皮肺活檢或其他經皮檢到的組織塊，還用于TBNA到的條形組織塊。（2）細胞刷涂抹（刷片）法。用于多數經氣管鏡刷片或用于其他較黏稠樣品。（3）噴片法與噴射推片法。用于多數FNA，也用于經皮細針吸引肺細胞學活檢或其他經皮檢到的細胞學標本，還用于TBNA得到的條形組織塊以外的細胞學標本。（4）液基薄層細胞制片（TCT）法。用于液基標本，如胸水或TBNA、FNA獲得的液基標本。（5）微孔濾膜過濾法。也用于液基標本。（6）涂抹法。用于痰液等黏稠的液體標本。

對于做好的ROSE制片，應根據患者實際情況適當采用以下方式進行快速染色：（1）極快速（30 s）改良瑞氏染色（Wright’s stain modified by Feng,WF染色）：它是在瑞氏染色基礎上加以改良所形成的一種極快速染色方式，耗時僅僅30 s，多數情況下1 min內就可以在顯微鏡下觀察。這種染色通用于絕大多數C-ROSE與M-ROSE，簡單、快速、直接、有效，是ROSE最常用的染色方式。通常，單做WF ROSE在大多數情況下就已經足夠了。而對于不熟悉WF ROSE的呼吸介入中心，也可直接采用瑞氏染色或瑞氏-吉姆薩染色，同樣能在數分鐘內完成。瑞氏和改良瑞氏染色主要由A液浸泡、磷酸鹽緩沖液浸泡、B液浸泡和清水清洗4步構成，然后立即用吸水紙吸干，上普通光學顯微鏡觀察。（2）極快速（10 s）改良乳酸染色：也叫改良乳酸酚棉蘭染色。這種染色主要應用于各類真菌。（3）快速（30 min）支原體DNA霍氏熒光染色：這種染色耗時30 min，主要應用于支原體感染。（4）快速（20 min）金-羅耐酸菌熒光染色：也叫金胺O-羅丹明熒光染色，主要應用于抗酸菌如結核分枝桿菌和努卡菌，也用于軍團菌。通常結核分枝桿菌和努卡菌為金胺O-羅丹明染色強陽性，而軍團菌染色可呈弱陽性。（5）試劑盒化快速（3 min）革蘭染色。這種染色主要應用于球菌和桿菌。根據筆者的經驗，WF染色完全可以實現革蘭染色的功能。

4 現代C-ROSE在臨床的應用情況

近些年來，C-ROSE在介入呼吸病學新技術應用中發揮了不可低估的作用。Loo等[5]將ROSE應用于電磁導航支氣管鏡（ENB），他將ROSE與正電子發射計算機斷層掃描（PET-CT）、ENB鉗檢和ENB刷檢結合起來用于對約2 cm的外周肺結節進行檢查，結果顯示ROSE可明顯提高診斷率，使總體診斷率達94%，且無任何操作相關并發癥的產生。在另一些研究中，ROSE技術被應用于ENB和熒光導航支氣管鏡技術中，也明顯提高了診斷率并減少了操作相關并發癥的發生[6-7]。經支氣管鏡超聲技術也是近幾年的一項新興技術。Collins等[8]將ROSE與該技術聯合應用進行TBNA，結果顯示同不使用ROSE相比，ROSE可減少33%的無謂穿刺和30%的無謂涂片，有68%的患者由于使用了ROSE技術，使得TBNA一次穿刺即獲得成功。類似的結果也見于其他一些使用ROSE的超聲支氣管鏡檢查中[9-10]。

最近也出現了一批高科技C-ROSE技術，例如具有“一站式快速診斷”之稱的波譜庫ROSE技術，可將玻片與波譜庫進行快速對比，從而立即獲得診斷。這些診斷不僅限于惡性腫瘤，對于良性疾病和微生物病原也有快速診斷能力[11]。也有C-ROSE工作者將遠程實時通訊技術應用于ROSE，使得一些ROSE水平欠發達的中心在介入呼吸病學操作中得到ROSE專家的指導[12]。

5 現代M-ROSE在臨床的應用情況

M-ROSE在歐美歷史悠久，但真正大規模臨床應用是近幾年才開始的，尤其是眾多呼吸重癥監護病房（ICU）建立起來后，如何獲得真正的感染致病原是困擾呼吸科與感染科醫生的一大問題。痰培養的臨床意義日趨受到弱化，呼吸ICU往往需要通過氣管鏡來采集真正意義上含有感染源的標本。介入呼吸病學采集感染源標本一般通過刷檢和BALF兩種方式進行。近年來，我中心（天津醫科大學總醫院呼吸科氣管鏡介入中心）通過TBLB采集肺組織進行微生物病原學檢查也取得了不錯的成效。肺活檢不像刷檢，它可以采集深部肺泡組織及其襯液，對于鑒別定植菌和侵襲性感染菌有一定臨床價值。但由于肺活檢采集到的標本小，菌落又通常不暴露于組織塊表面，需要將標本在培養皿上反復翻滾移動來進行細菌學種植培養。

由于苛養菌感染的日趨增加與定植菌的廣泛存在嚴重干擾了細菌培養的可信度，臨床醫生對于細菌培養越來越不看重。即使細菌培養來自于BALF，臨床醫生通常也僅僅將其作為參考。M-ROSE的真正優勢體現在微生物形態學和中性粒細胞、巨噬細胞或淋巴細胞吞噬細菌這兩大方面，更為重要的是，它可以提供明確的細胞學背景。很顯然，感染性疾病的細胞學背景如壞死、中性粒細胞與淋巴細胞的大量浸潤與非感染性疾病如哮喘的嗜酸性粒細胞為主的細胞學背景存在明顯差異，而慢性支氣管炎的杯狀細胞大量增生提示患者氣道的高分泌性。再如，緊密存在的上皮樣細胞和部分淋巴細胞提示肉芽腫性疾病的反應性增生，而不提示其他球菌、桿菌和真菌的感染。如果在此基礎上，細菌實驗室能夠提示陽性抗酸染色結果，或者ROSE中金胺O-羅丹明熒光染色陽性，則能夠確認結核病的診斷。而對于巨細胞病毒感染，細胞學背景在大多數情況下顯得十分明顯[13]。當然，如果能將M-ROSE形態學與其他更先進的微生物學方法如PCR、免疫熒光染色、流式細胞術、基因序列分析等相互結合，則能進一步提高M-ROSE的敏感性與特異性[14]。

在形態學方面，M-ROSE具備天然優勢。如果再將TBNA廣泛用于感染性疾病，就可以將TBNA和M-ROSE的作用同時發揮到極致，因為淋巴結尤其是隆突下淋巴結，是肺內各種病原的“天然收集器”，這一點在我中心的工作中已經得到了確認。M-ROSE對于真菌（尤其是處于菌絲時相的真菌）的確認相對容易，而且具有極高的靈敏度與特異度。這些容易確認的真菌包括隱球菌、芽生菌、組織胞漿菌、青霉菌和耶氏肺孢子菌，此外對于一些寄生蟲如瘧原蟲、利什曼蟲和剛地弓形蟲，M-ROSE也能較快得到診斷[13]。結合幾種MROSE方法，尤其是結合金胺O-羅丹明熒光染色法以后，對于結核也有很高的檢出率。

中性粒細胞和肺泡巨噬細胞是機體對抗肺部細菌感染的主要防御機制。中性粒細胞、巨噬細胞或淋巴細胞吞噬細菌現象對感染性疾病的微生物病原有明確的提示意義。而當患者罹患血液系統疾病、免疫缺陷性疾病或處于免疫抑制藥物治療中時，吞噬細菌現象將會明顯受到抑制。中性粒細胞介導的吞噬功能分為趨化（吞噬細胞向炎癥部位遷移）、吞噬細胞表面顆粒黏附、吞噬和呼吸爆發以及氧依賴機制這幾步，最后完成細菌細胞內死亡[15]。采用BALF快速TCT制片結合WF M-ROSE在中性粒細胞和肺泡巨噬細胞吞噬細菌方面可以獲得較高的陽性率，我中心在此方面做了大量的工作，取得了不錯的陽性率和符合率。

6 如何卓有成效地開展ROSE工作

盡管ROSE技術有較多優點，但在很多介入中心，該技術尚未得到廣泛開展。主要原因為：（1）在很多醫療中心，即使是在病理科，也缺少專門致力于快速細胞學評價的專家，病理學家一般對組織病理學更熱衷，在時間和精力上更愿意投入。即使有，這些細胞學專家也不愿意放下日常工作，將大量時間投入到介入呼吸病中心來。（2）缺乏經驗。介入中心的醫生與技術人員由于在病理學與微生物學方面經驗欠缺，做ROSE工作時不知如何操作。（3）缺少必要的熱情。由于在最初的ROSE工作中沒能得到良好的效果，認為ROSE臨床意義不足，從而放棄在這方面再繼續做工作。（4）認為耽誤介入操作的進度。這往往是由于ROSE開展的不夠好和不夠成熟，制片與快速染色時間過長導致。（5）人力、財力及物力上的成本不能保證。

我中心每年平均開展ROSE約1 500例，在C-ROSE和M-ROSE方面都取得了不少心得。目前我中心在C-ROSE方面與術后組織病理學的符合率將近100%，在結核病方面約70%，在真菌等M-ROSE方面臨床符合率也能超過90%。圖1～8為我中心開展ROSE工作以來所拍攝的典型ROSE圖片，分別為在痰涂片、胸水TCT、BALF、TBLB、TBNA、胸腔鏡、中性粒細胞吞噬細菌和TBLB真菌形態學方面的應用情況。更欣慰的是，筆者發現在WF ROSE制片的基礎上，可以直接進行染色體FISH的操作。通過普通光學顯微鏡與熒光顯微鏡的實時游標照片對比，可以避免傳統細胞學FISH的缺陷，真正實現了細胞學FISH的科學性，見圖9。作為ROSE工作者，應該具備如下能力：（1）要全身心地投入，對ROSE制片要能認、敢認、認對。（2）還要有龐雜的交叉學科知識，ROSE涉及常規呼吸病學、腫瘤學、介入呼吸病學、病理學、細胞學、臨床微生物學等多學科的綜合知識。（3）分析ROSE結果的時候還要有嚴密的臨床專科邏輯整合能力。應結合病史、查體、影像學、實驗室檢查等綜合分析，做出正確判斷。這就決定了呼吸科介入中心醫師自己進行ROSE工作不可替代的天然優勢。這些醫生自己問病史、自己查體、會看CT、結合臨床檢驗，再自己取標本，判讀ROSE結果的時候一切心中有數，甚至能夠預判。ROSE工作者要在長期的ROSE工作中，積累豐富的經驗，不斷提高臨床素養。希望更多的介入中心將更多的時間和精力投入到ROSE中來，使得ROSE這朵“玫瑰花”芬芳綻放，春色滿園。

Figure 1 WF ROSE(rapid on site evaluation with Wright’s stain modified by Feng)of sputum smear suggests the pathological diagnosis of adenocarcinoma圖1 痰涂片WF ROSE提示為腺癌（×400）

Figure 2 WF ROSE of pleural effusion TCT(thinprep cytology test)suggests the pathological diagnosis of adenocarcinoma圖2 胸水TCT WF ROSE提示為腺癌（×400）

Figure 3 WF ROSE of BALF(bronchoalveolar lavage fluid)TCT suggests the pathological diagnosis of adenocarcinoma圖3 支氣管肺泡灌洗液TCT WF ROSE提示為腺癌（×400）

Figure 4 WF ROSE of TBLB(transbronchial lung biopsy)TIC(touch imprint cytology)suggests the pathological diagnosis of tuberculosis圖4 經氣管鏡肺活檢滾片WF ROSE提示為結核病（×400）

Figure 5 WF ROSE of TBNA(transbronchial needle aspiration)TIC suggests the pathological diagnosis of small cell lung cancer圖5TBNA滾片WF ROSE提示為小細胞肺癌（×400）

Figure 6 WF ROSE of thoracoscopy biopsy TIC from parietal pleura suggests the pathological diagnosis of adenocarcinoma圖6 內科胸腔鏡壁層胸膜活檢滾片WF ROSE提示為腺癌（×400）

Figure 7 WF ROSE of TBLB TIC suggests the cytophagy of staphylococcus aureus by neutrophile granulocyte圖7 經氣管鏡肺活檢滾片WF ROSE提示為中性粒細胞吞噬金黃色葡萄球菌（×1 500）

Figure 8 WF ROSE of TBLB TIC suggests the pathological diagnosis of invasive bronchial pulmonary aspergillosis圖8 經氣管鏡肺活檢滾片WF ROSE提示為侵襲性支氣管肺曲霉病（×400）

Figure 9 Comparative images of FISH(fluorescence in situ hybridization)results for EGFR(epidermal growth factor receptor)on the basis of WF ROSE from TBLB TIC圖9 在經氣管鏡肺活檢滾片WF ROSE制片的基礎上進行的表皮生長因子受體（EGFR）染色體FISH的結果（×1 000；左：普通光顯微鏡圖片；右：熒光顯微鏡圖片。）

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（2013-12-20收稿 2013-12-30修回）

（本文編輯 閆娟）

It’s Time for This“ROSE”to Flower:Rapid on Site Evaluation in Interventional Pulmonology

FENG Jing1,CHEN Baoyuan1,WU Qi2
1 Department of Respiratory,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2 Tianjin Haihe Hospital

Rapid on site evaluation(ROSE)technology of interventional pulmonology includes“cytological ROSE”(C-ROSE)and“microbiological ROSE”(M-ROSE).Recently,this“ROSE”has gradually become one of core technologies in modern interventional pulmonology.In this commentary,perspectives on origin and development,classification and clinical value,operational approach,clinical application,and how to carry out effective work related to ROSE were summarized and remarked.

rapid on site evaluation;interventional pulmonology;cytology;microbiology;pathology

馮靖，男（1973.10～），博士，主任醫師。美國杜克大學博士后、NIH/NIEHS博士后，斯坦福大學訪問學者。天津醫科大學總醫院呼吸科行政副主任。主要研究方向：介入呼吸病學和睡眠呼吸障礙。主持國家自然科學基金2項，參加國家自然科學基金2項，國家十五科技攻關課題1項。獲天津市科技進步三等獎2項，天津醫科大學科技成果二等獎1項，獲局級獎勵3次。現任中國睡眠研究會青年委員會副主任委員、中華醫學會呼吸病分會組織委員會委員和青年委員、天津市醫學會呼吸病學會青年委員會副主任委員、衛生部海峽兩岸醫藥衛生交流協會呼吸專業委員會委員、國家自然科學基金評議專家、國家來華留學生教學專業委員會委員。《天津醫藥》、《中華醫學雜志英文版》、《歐洲呼吸病雜志》特邀審稿專家。以第一或通訊作者發文63篇，SCI收錄22篇。

R562 【

】 C 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.001

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：81270144、30800507、81170071）

1天津醫科大學總醫院呼吸科（郵編300052）；2天津市海河醫院