香加皮杠柳苷對人肺癌QG56細胞抑制作用的研究*

張 靜 楊 光 趙學濤 單保恩 劉江惠

細胞與分子生物學

香加皮杠柳苷對人肺癌QG56細胞抑制作用的研究*

張 靜1楊 光2趙學濤3單保恩3劉江惠3

目的研究香加皮杠柳苷（CPP）對人肺癌QG56細胞的抑制作用及其作用機制。方法體外培養人肺癌QG56細胞，設對照組和終濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/L的CPP（CPP 1～5）組，每組設3個平行孔，分別培養24、48、72 h。采用MTT法檢測CPP對QG56細胞增殖的影響；倒置顯微鏡觀察CPP處理前后細胞形態變化；流式細胞術檢測細胞凋亡和周期分布；RT-PCR法檢測CPP作用后QG56細胞中凋亡相關基因bax mRNA表達情況；免疫細胞化學法檢測CPP對QG56細胞bax蛋白表達的影響。結果隨CPP濃度的增加、作用時間的延長，細胞增殖抑制率明顯增高。顯微鏡下可見CPP處理后的QG56細胞變圓，皺縮，呈懸浮狀態。隨CPP濃度的增加，G0/G1期細胞比例增高，而S期和G2/M期細胞比例減少,QG56細胞凋亡率明顯增高。CPP 2組經CPP作用48 h后，細胞凋亡率高于對照組，CPP 3組經CPP作用24 h后，細胞凋亡率均高于對照組，CPP 4組經CPP作用12 h后，細胞凋亡率均高于對照組（均P＜0.05）。CPP 2～4組經CPP作用48 h時QG56細胞中bax mRNA和蛋白的表達明顯增強。結論CPP可通過阻滯細胞周期和誘導凋亡發揮對人肺癌QG56細胞的抑制作用。

肺腫瘤；香加皮；杠柳；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡；原癌基因蛋白質c-bcl-2；香加皮杠柳苷；bax

肺癌是常見惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居我國惡性腫瘤的第一位[1]。鱗癌是肺癌中最常見的病理類型，占原發性肺癌的40%～50%。然而，目前尚缺乏針對肺鱗癌的靶向藥物，臨床現有的化療藥物總體療效也并不理想，且不良反應較大。本課題組前期研究發現，中藥香加皮的提取物具有明顯的抗腫瘤作用[2]，香加皮杠柳苷（periplocin from cortex periplocae，CPP）是從香加皮中分離提取的單體化合物[3]。本研究在前期工作的基礎上，進一步探索CPP對人肺癌QG56細胞增殖的影響及機制，以期發現對肺鱗癌有效的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 CPP分離純化自中藥香加皮，由華北制藥集團新藥研究開發中心提供。人肺癌QG56細胞株由日本產業醫科大學饋贈。RPMI1640培養基、RT-PCR酶混合物、Trizol液（美國GIBCO公司）；噻唑藍（MTT）、碘化丙啶（PI，美國Sigma公司）；bax及β-actin引物（上海生物工程公司）；兔抗人bax多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中山生物技術公司）。PCR儀（美國ABI公司），Epics-XLⅡ流式細胞儀（FCM，美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人肺癌QG56細胞按常規方法復蘇后，置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640完全培養基中，37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞備用。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖活性 調整QG56細胞懸液細胞濃度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。設對照組和終質量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/L的CPP（CPP 1～5）組，每組設3個平行孔，分別培養24、48、72 h。終止實驗時每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min。酶標儀內于波長570 nm測定光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率（inhibitory rate,IR）=（1－CPP組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 應用倒置顯微鏡觀察CPP處理前后QG56細胞的形態學變化。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡 取對照組和CPP 2、CPP 3、CPP 4組QG56細胞，培養6、12、24、48、72 h，分別收集細胞1×106個，以70%乙醇固定過夜，PBS離心洗去乙醇，加入PI染色，應用FCM分析細胞周期和細胞凋亡率。

1.2.5 RT-PCR檢測bax mRNA表達 取對照組和CPP 2、CPP 3、CPP 4組QG56細胞培養48 h，用Trizol提取液提取各組細胞總RNA，并檢測RNA的純度和完整性。以β-actin為內參照，每批PCR均設空白對照。引物序列為bax上游5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′，下 游 5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′，擴增片段大小為 345 bp；β-actin 上游 5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，下 游 5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，擴增片段大小為619 bp[4-5]。按RT-PCR酶混合物試劑盒說明進行實驗，反應30個循環。將RT-PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，應用FOTODYNE凝膠成像系統成像分析。

1.2.6 免疫細胞化學法測定bax蛋白的表達 取對照組和CPP 2、CPP 3、CPP 4組QG56細胞接種于6孔板中爬片培養，48 h后棄去培養基，PBS洗滌，按SP免疫細胞化學法和試劑盒說明書進行染色、固定，鏡下觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CPP對QG56細胞增殖的影響 隨著CPP濃度的增加、作用時間的延長，OD值明顯降低（均P＜0.05），IR明顯增高，見表1。

2.2 CPP作用后細胞形態學變化 對照組QG56細胞呈單層貼壁生長，為多邊形；經CPP作用后，細胞脫離生長面，皺縮變圓，折光減弱，見圖1。

2.3 CPP對QG56細胞周期的影響 經不同質量濃度（2.50、5.00、10.00 μg/L）CPP 作用 24 h后，各組QG56細胞周期變化明顯。隨著CPP質量濃度的增加，G0/G1期細胞比例增高，而S期和G2/M期細胞比例減少，見圖2、表2。

2.4 CPP對QG56細胞凋亡的影響 隨著CPP濃度的增加、作用時間的延長，QG56細胞凋亡率明顯增高。CPP 2組經CPP作用48 h，細胞凋亡率均高于對照組，CPP 3組經CPP作用24 h后，細胞凋亡率高于對照組，CPP 4組經CPP作用12 h后，細胞凋亡率高于對照組（均P＜0.05），見圖3。

2.5 CPP對QG56細胞bax基因表達的影響 CPP 2～4組經CPP作用48 h時QG56細胞中bax mRNA的表達明顯增強，空白對照組無任何條帶，見圖4。

Table 1 The effect of CPP on the proliferation of QG56 cells表1 CPP對QG56細胞增殖的影響 (n=3±s)

Table 1 The effect of CPP on the proliferation of QG56 cells表1 CPP對QG56細胞增殖的影響 (n=3±s)

F1：同一時點組間OD值比較;F2：組內不同時點OD值比較；＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CPP1組比較，c與CPP2組比較，d與CPP3組比較，e與CPP4組比較，P＜0.05；＃與24 h時比較，＆與48 h時比較，P＜0.05

F2組別對照組CPP 1組CPP 2組CPP 3組CPP 4組CPP 5組IR（%）-8.39 19.26 44.52 64.81 83.22 IR（%）-14.88 38.52 62.33 76.96 88.52 IR（%）-21.47 48.27 71.68 83.85 92.73 0.475 25.737＊＊183.772＊＊190.266＊＊81.392＊＊12.171＊＊F1 24 h OD值1.168±0.019 1.070±0.011a0.943±0.018ab0.648±0.016abc0.411±0.021abcd0.196±0.024abcde848.721＊＊48 h OD值1.176±0.011 1.001±0.021a＃0.723±0.015a＃0.443±0.016ab＃0.271±0.009abc＃0.135±0.017abcd＃1 441.218＊＊72 h OD值1.183±0.015 0.929±0.018a＃＆0.612±0.021ab＃＆0.335±0.013abc＃＆0.191±0.014abcd＃＆0.086±0.012abcde＃＆1 484.225＊＊

Table 2 Comparison of the QG56 cell cycle distributions after treatment with CPP for 24 h表2 CPP作用24 h后QG56細胞周期分布的比較 （n=3,%,±s）

Table 2 Comparison of the QG56 cell cycle distributions after treatment with CPP for 24 h表2 CPP作用24 h后QG56細胞周期分布的比較 （n=3,%,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CPP 2組比較，c與CPP 3組比較，P＜0.05

組別對照組CPP 2組CPP 3組CPP 4組F G0/G1期45.36±4.38 59.28±2.75a68.95±3.64ab77.12±2.45abc32.428＊＊S期35.69±3.82 23.93±1.85a20.16±1.96a15.23±2.09ab23.190＊＊G2/M期18.95±2.56 16.79±4.25 10.89±4.73a7.65±0.91ab4.548＊

Figure 3 Effects of CPP on the apoptotic rate of QG56 cells圖3 CPP對QG56細胞凋亡率的影響

2.6 CPP對QG56細胞bax蛋白表達的影響 bax蛋白主要分布在胞漿和核膜周圍，胞質中呈棕黃色或棕褐色顆粒著色者為陽性細胞。與對照組相比，CPP藥物組QG56細胞中的陽性細胞明顯增多，bax蛋白表達顯著增強，見圖5。

3 討論

本課題組前期研究表明香加皮乙酸乙酯提取物對人乳腺癌MCF-7細胞具有增殖抑制活性[2]。CPP是在香加皮粗提物的基礎上進一步分離純化得到的單體。本研究結果顯示CPP能顯著抑制QG56細胞的增殖，且隨藥物濃度增加和作用時間延長，其抑制活性增強，提示CPP具有體外抗腫瘤作用。腫瘤的發生、發展與細胞周期和細胞凋亡密切相關[6-7]。阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡是抗腫瘤藥物的重要作用機制[8-9]。本研究結果顯示，CPP組QG56細胞中G0/G1期細胞顯著增多，S期和G2/M期細胞明顯減少，提示CPP可使QG56細胞發生細胞周期阻滯，將細胞阻滯于G0/G1期。另外，CPP組QG56細胞的凋亡率明顯升高，提示CPP可誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果與課題組前期有關香加皮抑制乳腺癌細胞的作用機制一致[2]，再次驗證CPP抗腫瘤作用與阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡有關。

bax是研究最廣泛的bcl-2家族中的促凋亡基因，其翻譯產物可與bcl-2等抑凋亡蛋白，通過細胞線粒體途徑，調節細胞凋亡[10]。本研究結果顯示，CPP可使QG56細胞中bax基因的mRNA和蛋白表達水平顯著增強，進一步提示CPP對人肺癌QG56細胞的抑制作用與誘導細胞凋亡有關，并可能通過上調bax基因的表達而發揮誘導凋亡作用。但本研究僅在分子水平對CPP的作用進行了初步探討，具體的分子機制和作用途徑，以及是否有bcl-2家族中其他成員或信號轉導通路的多個靶點參與，有待進一步的深入研究。

Figure 1 The morphological changes of QG56 cells after CPP treatment(×200)圖1 CPP作用后QG56細胞形態學變化(×200)

Figure 2 The QG56 cell cycle distributions detected by flow cytometry圖2 FCM分析細胞周期時相分布

Figure 4 Effects of CPP on the expression of bax mRNA圖4 CPP對bax mRNA表達的影響

Figure 5 The effect of CPP on the expression of bax in QG56 cells(SP，×400)圖5 CPP對QG56細胞中bax蛋白表達的影響(SP，×400)

[1]郝捷.2012中國腫瘤登記年報[M].北京:軍事醫學科學出版社,2012:12.

[2]張靜,單保恩,劉剛叁,等.香加皮乙酸乙酯提取物誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的研究[J].腫瘤,2006,26(5):418-421.

[3] 陳書紅,楊峻山,任風芝,等.香加皮的抗腫瘤活性成分研究(Ⅱ)[J].中草藥,2006,37(4):519-520.

[4]Lee Y,Kim H,Lee J,et al.Anticancer activity of S-allylmercapto-L-cysteine on implanted tumor of human gastric cancer cell[J].Biol Pharm Bull,2011,34(5):677-681.

[5]Schmidt GW,Delaney SK.Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nicotiana tabacum)during development and abiotic stress[J].Mol Genet Genomics,2010,283(3):233-241.

[6] Casimiro MC,Crosariol M,Loro E,et al.Cyclins and cell cycle control in cancer and disease[J].Genes Cancer,2012,3(11-12):649-657.

[7]Sayers TJ.Targeting the extrinsic apoptosis signaling pathway for cancer therapy[J].Cancer Immunol Immunother,2011,60(8):1173-1180.

[8] Alabsi AM,Ali R,Ali AM,et al.Apoptosis induction,cell cycle arrest and in vitro anticancer activity of gonothalamin in a cancer cell lines[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(10):5131-5136.

[9]王巨存,胡永成,潘振華,等.小檗胺對大鼠骨肉瘤UMR-106細胞增殖的抑制作用[J].天津醫藥,2012,40(10):1030-1033.

[10]Renault TT,Manon S.Bax:Addressed to kill[J].Biochimie,2011,93(9):1379-1391.

（2013-07-10收稿 2013-10-20修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Inhibitory Effects of Periplocin from Cortex Periplocae on Human Lung Cancer Cell Line QG56

ZHANG Jing1,YANG Guang2,ZHAO Xuetao3,SHAN Baoen3,LIU Jianghui3
1 Department of Rehabilitation，The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China；2 Department of Radiology，3 Research Center

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of periplocin from cortex periplocae(CPP)on human lung cancer cell line QG56 and to discuss its mechanism.MethodsQG56 cells were cultured in vitro.The final concentrations of CPP in control group were 1.25,2.50,5.00,10.00 and 20.00 μg/L.QG56 cells were treated with ascending concentration of CPP for 24 h,48 h and 72 h.The cell proliferation was measured using MTT method.The morphological changes of QG56 cells were observed under inverted microscope.Flow cytometry(FCM)was used to detect the effects of CPP on cell cycle and cell apoptosis.The expression of apoptosis associated gene bax mRNA in QG56 cells was detected by RT-PCR.The expression of bax protein before and after treatment of CPP was examined by SP immunocytochemistry.ResultsThe inhibitory effect of CPP on the proliferation of QG56 cells was increased with the increasing concentrations of CPP and the prolonged duration of treatment.The morphological changes were displayed in QG56 exposed to CPP.The results of FCM showed that CPP caused cell cycle arrest at G0/G1phase.The apoptotic rate of QG56 cells was significantly increased after CPP treatment for 48 h(P＜0.05).The expression of bax mRNA was increased in QG56 exposed to CPP.The result of immunocytochemistry indicated that CPP up-regulated the expression of bax protein.ConclusionCPP showed significant inhibitory effect on human lung cancer cell lines QG56 through inducing cell cycle arrest and apoptosis．

lung neoplasms;Cortex Periplocae;Periploca Sepium;cell proliferation;cell cycle;apoptosis;proto-oncogene proteins c-bcl-2;periplocin from cortex periplocae;bax

R734.2 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.002

*國家自然科學基金資助項目（項目編號:30772752）

1河北醫科大學第四醫院康復科（郵編050011），2放射科，3科研中心