普伐他汀對大鼠急性心肌梗死后熱休克蛋白B7表達的影響*

蔣友旭 張麗華 王小曼 李盼盼

普伐他汀對大鼠急性心肌梗死后熱休克蛋白B7表達的影響*

蔣友旭 張麗華△王小曼 李盼盼

目的觀察急性心肌梗死（AMI）大鼠梗死區心肌組織中熱休克蛋白B7（HSPB7）mRNA和蛋白的表達水平，研究普伐他汀對HSPB7表達的干預作用。方法80只AMI大鼠隨機分為AMI組和普伐他汀（P）組，每組40只，同時設假手術（SH）組大鼠40只，再將3組大鼠分為1、3、6和12 h組，每個時間組10只。SH組開胸后不結扎冠脈；AMI組開胸后結扎冠狀動脈左前降支；P組開胸后結扎冠狀左前降支，同時給予普伐他汀0.5 mg/（kg·d）灌胃；其余組給予等量蒸餾水灌胃。分別于各時間點處死大鼠，取左心室梗死區心肌組織，SH組取對應部位的心肌組織，分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和免疫組化法檢測HSPB7 mRNA和蛋白的表達。結果AMI組和P組大鼠各時點梗死區心肌組織HSPB7 mRNA和蛋白表達均高于SH組（P＜0.01）；梗死后1 h，梗死區心肌HSPB7 mRNA和蛋白的表達增加，在3 h時達到高峰，6 h組、12 h組HSPB7 mRNA和蛋白的表達仍高于SH組。且P組中各時間點HSPB7的表達高于AMI組。結論HSPB7能夠在AMI早期表達，普伐他汀可促進AMI后梗死區心肌組織HSPB7表達，可能是其在心梗早期起到保護心肌作用的機制之一。

熱休克蛋白質類；普伐他丁；心肌梗死；急性病；疾病模型,動物；熱休克蛋白B7

急性心肌梗死（AMI）是冠心病的嚴重類型，近年來發病率呈明顯上升趨勢，且是心源性猝死的主要原因之一。AMI主要是由于易損斑塊破裂和血栓形成所致，其中炎癥反應起重要作用。AMI起病急、病情重、變化快、并發癥多，因此早期對AMI患者進行干預和治療顯得尤為重要。熱休克蛋白B7（HSPB7）作為一種小分子蛋白質，只特異性地在心肌細胞中表達[1]，在心肌細胞受損早期起到保護作用。近年來偶見HSPB7與心力衰竭相關性的研究，但是其在AMI后表達的研究甚少。本實驗通過建立大鼠AMI模型，觀察心肌梗死后心肌組織中HSPB7表達的變化及普伐他汀對其影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康清潔級SD大鼠120只，體質量250～300 g（鄭州大學實驗動物中心）。普伐他汀鈉片（20 mg/片，國藥準字H20040100），兔抗大鼠HSPB7多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司，HSPB7和β-actin（內參）引物、總RNA提取、逆轉錄和擴增試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司。小動物呼吸機（HX-300S，成都泰盟科技有限公司）。圖像采集：德國Lecia顯微照像系統。Biosens Digital Imaging System v1.6分析系統（上海山富科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AMI模型的制備及分組 SD大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，氣管插管并連接標準肢體導聯動態監測心電圖。于胸骨左緣外3～4肋間觸及心臟搏動最強處縱行切開皮膚，止血鉗依次分離各層組織至肋骨，連接并打開呼吸機后觀察到大鼠機械呼吸后，打開胸腔，充分暴露心臟，在左心耳和肺動脈錐間距主動脈根部約2～3 mm處用6.0無創傷縫線穿過冠狀動脈左前降支（LAD）并結扎。結扎后，前壁心肌組織顏色由鮮紅迅速變為暗紅，隨后逐漸變為白色，心電圖監測Ⅰ和avL導聯ST段較前上抬＞0.2 mV表示手術成功。關閉胸腔后逐層縫合組織，待大鼠出現自主呼吸拔出氣管插管。術后將存活的80只AMI大鼠按隨機數字表法分為AMI組和普伐他汀（P）組，再將上述2組隨機分為1、3、6和12 h組，每組10只。假手術（SH）組于相同部位穿過縫合線，不結扎，余操作同AMI各組。術后存活的SH組大鼠隨機分為上述4個時間組，每組10只，共40只。普伐他汀組給予普伐他汀0.5 mg/（kg·d），于術后立即灌胃；其余各組給予等量生理鹽水。

1.2.2 心臟標本的提取及處理 分別于術后1、3、6和12 h處死大鼠，迅速取出心臟，生理鹽水沖洗后取左心室前壁心梗區組織作為標本。

1.2.3 HSPB7蛋白表達的檢測 采用免疫組化SP方法，按照試劑盒說明操作，DAB顯色。用已知陽性切片作為陽性對照，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為HSPB7陽性表達，每張切片隨機讀取5個視野（400倍）進行圖像采集。應用Biosens Digital Imaging System v1.6對所采集照片的免疫組化染色的平均光密度（OD）值進行測量，用平均光密度×選定對象的面積計算積分光密度（IOD），重復3次取平均值。

1.2.4 HSPB7 mRNA表達的檢測 采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法。取心肌標本組織約100 mg，加入液氮完全研碎。按試劑盒說明提取RNA，逆轉錄為cDNA。上游引物為 5′-CAGAGGACTTTGGCAGTTTCA-3′，下游引物為 5′-GATGTGGTTGTTGGAGGTGGT-3′，擴增產物為170 bp；β-actin上游引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTAC-3′，下游引物為5′-GGAAGGTGGACAGTGAG-3′，擴增產物為 568 bp。PCR擴增體系：取逆轉錄產物2 μL，上、下游引物各1 μL，酶緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶 0.5 μL，補水到50 μL。擴增條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環；72℃總延伸6 min。取PCR產物，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像分析系統進行成像，Quantity One軟件分析后計算HSPB7與β-actin灰度值的比值代表其相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計量資料用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HSPB7免疫組化結果 免疫組織化學染色示，SH組可見微量的棕黃色顆粒沉著，主要分布于細胞周邊；AMI組可見大量壞死心肌細胞，并有中等量棕黃色顆粒，周邊和中央均有分布；P組切片可見一定量壞死細胞，大量的棕黃色顆粒，主要分布于細胞中央，見圖1。與SH組相比，AMI組和P組各時間點HSPB7蛋白表達均明顯增加，且P組高于AMI組（均P＜0.01），見表1。

Table 1 Comparison of the positive gray area of HSPB7 protein between three groups表1 各組HSPB7蛋白陽性區灰度值比較（n=10，IOD，ˉ±s）

Table 1 Comparison of the positive gray area of HSPB7 protein between three groups表1 各組HSPB7蛋白陽性區灰度值比較（n=10，IOD，ˉ±s）

＊＊P＜0.01；a與SH組比較，b與AMI組比較，P ＜ 0.01;表2同

組別SH組AMI組P組F 1 h 95.58±1.55 125.46±1.77a130.60±2.23ab105.602＊＊3 h 94.69±1.73 132.05±1.96a173.17±1.53ab511.231＊＊6 h 95.04±1.32 119.96±1.95a131.74±1.24ab110.604＊＊12 h 94.15±1.59 109.26±1.24a118.51±1.55ab64.548＊＊

2.2 HSPB7 RT-PCR結果 與SH組比較，AMI組和P組HSPB7 mRNA相對表達量均升高，P組高于AMI組（均P ＜ 0.01），見表2、圖2。

Table 2 Comparison of the expression of HSPB7 mRNA between three groups表2 各組HSPB7 mRNA相對表達量比較（n=10，ˉ±s）

Table 2 Comparison of the expression of HSPB7 mRNA between three groups表2 各組HSPB7 mRNA相對表達量比較（n=10，ˉ±s）

組別SH組AMI組P組F 1 h 0.11±0.02 0.36±0.02a0.43±0.02ab844.620＊＊3 h 0.11±0.02 0.65±0.02a0.83±0.02ab3 446.024＊＊6 h 0.11±0.02 0.25±0.01a0.33±0.01ab529.992＊＊12 h 0.12±0.03 0.17±0.01a0.22±0.01ab170.005＊＊

Figure 2 The expression of HSPB7 mRNA detected by RT-PCR圖2RT-PCR檢測HSPB7 mRNA的表達

3 討論

3.1 HSPB7及普伐他汀在AMI時的作用機制 AMI主要是由于冠狀動脈內形成閉塞，使心肌嚴重而持久地缺血缺氧，導致心肌細胞壞死、凋亡。AMI時心肌細胞缺血缺氧能夠啟動熱休克反應，小分子熱休克蛋白家族（sHSP）是人體在發生熱休克反應時的主要產物，sHSP的過度表達能夠促進缺血缺氧的心肌細胞快速復氧[2]，并且通過抑制應激活化蛋白激酶、半胱氨酸蛋白酶活性的表達[3]，阻止心肌細胞的凋亡和壞死[4-5]。HSPB7是sHSP家族成員之一，Chiu等[6]已經證實在無胸痛癥狀的早期心肌梗死患者血漿中能夠檢測出HSPB7的表達。HSPB7是在阻止細胞壞死過程中表達最為活躍的小分子蛋白質[7]，它能夠阻止多聚谷氨酰胺（PolyQ）蛋白低聚化和形成聚合物，降低PolyQ的毒性，從而防止心肌細胞的凋亡[8]。在AMI時，心肌組織中的HSPB7能夠從細胞質基質中轉位到肌原纖維的Z帶或者I帶上，促進肌動蛋白的聚合，參與細胞骨架的穩定[9]，因此HSPB7可以在應激的情況下阻止變性的細胞骨架蛋白重新折疊，從而起到保護心肌細胞的作用。AMI過程中的另一重要改變是急性炎癥反應，已有研究表明炎癥反應在AMI的形成和發展中起關鍵作用[10]。普伐他汀為第3代他汀類藥物，在降低血脂、穩定斑塊方面起重要作用。近年來關于普伐他汀在急性炎癥反應過程中的作用成為熱點。Bustos研究小組證實普伐他汀能夠在早期細胞受損的3～5 h內參與炎癥反應過程，誘導sHSP大量表達，sHSP可作用于多種炎性細胞和免疫調節細胞，通過抑制炎癥細胞聚集和抑制炎癥細胞與內皮細胞黏附等一系列反應來達到其抗炎的作用[11]。

3.2 HSPB7在AMI模型的表達及普伐他汀對其表達的影響 本研究顯示，AMI后HSPB7表達增加，并且在普伐他汀的作用下刺激HSPB7大量表達，可能是普伐他汀在AMI過程中保護心肌細胞的機制之一。在不同時間點觀察，與SH組相比，AMI組和P組梗死后1 h，梗死區心肌HSPB7 mRNA和蛋白的表達即可升高，在3 h時達到高峰，6 h組、12 h組mRNA和蛋白的表達仍高于SH組，提示HSPB7能夠在AMI早期迅速表達，在癥反應的早期即可通過提高心肌細胞的抗氧化能力，穩定細胞骨架，抵抗缺血再灌注所帶來的損傷，進而對細胞凋亡起到一定的阻止作用。

綜上所述，本研究初步表明，HSPB7能夠在AMI早期表達，普伐他汀可促進AMI后梗死區心肌組織HSPB7表達。在AMI的早期進行HSPB7水平的檢測并服用他汀類藥物可能為AMI的早期診治提供新的思路，值得進一步研究。

Figure1 The expression of HSPB7 protein detected by immunohistochemistry（SP,×400）圖1 HSPB7蛋白免疫組化染色結果（SP,×400）

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（2013-05-06收稿 2013-09-22修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effect of Pravastatin on the Expression of HSPB7 in Acute Myocardial Infarction Rats

JIANG Youxu,ZHANG Lihua,WANG Xiaoman,LI Panpan
Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University,Zhengzhou 450014，China

ObjectiveTo observe the effect of pravastatin on the expression of heat shock protein B7(HSPB7)in acute myocardial infarction(AMI)rats.MethodsA total of 80 AMI rats were randomly divided into AMI group and pravastatin(P)group.Forty SD rats were used as sham operation(SH)group.Rats were then subdivided into 1 h,3 h,6 h and 12 h subgroups(10 for each group).Rats were not ligated after thoracotomy in SH group.The 1eft anterior descending coronary artery was ligated in rats of AMI group.The 1eft anterior descending coronary artery was ligated in P group and given intragastric administration of 0.5 mg/(kg·d)pravastatin.The other groups were given the same amount of normal saline via gavage.The left ventricle infarcted myocardial tissues were taken at each time intervals.The corresponding myocardial tissues were harvested in sham-operated rats.The HSPB7 mRNA and protein expressions were measured by RT-PCR and immunohistochemistry respectively．ResultsThe expression levels of HSPB7 mRNA and protein were significantly higher in the AMI group and P group than those of SH group(P＜0.01).The expression levels of HSPB7 mRNA and protein were significantly increased 1 h after AMI and reached the peak value at 3 h after AMI.The expression levels of HSPB7 mRNA and protein were still higher in 6-h group and 12-h group than those of SH group.The expression levels of HSPB7 were higher in different time points of P group than those of AMI group.ConclusionHSPB7 could express in the early stage of acute myocardial infarction in rats.Pravastatin could promote the upregulation of HSPB7 in myocardial infarcted border zone after AMI，which may play a protective role in early myocardial infarction.

heat-shock proteins ；pravastatin；myocardial infarction；acute disease；disease models,animal；HSPB7 protein

R542.2 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.011

*河南省醫學科技攻關計劃項目（項目編號：201204029）

鄭州大學第二附屬醫院心血管內科（郵編450014）

△通訊作者 E-mail：zlhxp@126.com