缺氧預處理對骨髓來源內皮祖細胞生物學功能的影響*

薛奮龍 陳慶良 簡鍇陶△ 劉建實 郭志剛 姜 楠

缺氧預處理對骨髓來源內皮祖細胞生物學功能的影響*

薛奮龍1陳慶良2簡鍇陶2△劉建實2郭志剛2姜 楠2

目的研究缺氧條件對骨髓來源內皮祖細胞（BM-EPCs）生物學功能的影響。方法經密度梯度離心法獲得大鼠骨髓來源單核細胞，接種在包被有大鼠玻連蛋白的培養皿中，加入內皮細胞生長培養基-2，于常規培養條件（37℃、5%CO2）下培養，第4天時，棄去未貼壁細胞，全量更換新鮮培養基，隨機分為常規培養組和缺氧培養組，常規培養組于常規培養條件下繼續培養至第7天；缺氧培養組分別于常規培養的第4、5、6天，于缺氧培養條件（1%O2+5%CO2+94%N2）下繼續培養72、48、24 h；細胞表面標志物檢測并Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白和FITC標記的荊豆凝集素1共同染色方法鑒定BM-EPCs，分別對各組培養至第7天的細胞進行內皮分化功能檢測（Matrigel Assay）和抗凋亡檢測（Annexin V/PI）。結果隨著缺氧處理時間延長，BM-EPCs早期凋亡率增加明顯。與常規培養組（0.89±0.20）%相比，缺氧培養24 h組早期凋亡率（1.33±0.07）%改變不明顯（P ＞0.05），缺氧培養48 h組（3.25±0.12）%、72 h組（7.48±1.53）%，早期凋亡率明顯增加（P＜0.05）。與常規培養組比較，缺氧培養24 h組的體外血管形成能力增強（P＜0.01），缺氧培養48、72 h組體外血管形成能力明顯下降（P＜0.01）。結論缺氧預處理BM-EPCs 24 h，BM-EPCs早期凋亡率增加不明顯，細胞體外血管形成能力明顯增強。

干細胞；內皮細胞；缺氧；新生血管化,生理性；細胞凋亡；大鼠,Wistar；骨髓來源內皮祖細胞

血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）主要存在于骨髓以及外周血中，不同來源內皮祖細胞生物學特征不同。由于骨髓微環境含氧量低，內皮祖細胞數目較多，骨髓來源的內皮祖細胞（BM-EPCs）被廣泛應用于腫瘤微環境、缺血缺氧性損傷、心臟病等疾病的干細胞治療研究。然而目前為止缺少統一的明確定義EPCs的表面標志物，多數情況下通過細胞形態、細胞吞噬Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）和FITC標記的荊豆凝集素1雙陽性以及細胞表面標志性表達CD133+/CD34+/FLK-1+定義為BM-EPCs[1-2]。缺氧環境有利于干細胞分化、增殖，可以明顯增強細胞的抗凋亡能力[3]。研究表明，缺氧可以明顯增強EPCs表面低氧誘導因子（HIF）-1α、趨化因子受體4（CXCR4）、血管內皮生長因子受體（VEGFR）等趨化因子表達，進而提高內皮祖細胞的遷移、歸巢、分化、增殖能力[4]。然而，缺氧環境影響EPCs生物學功能的最佳時間不甚明確。本研究旨在體外模擬正常骨髓缺氧微環境，觀察缺氧環境對BM-EPCs抗凋亡能力及內皮分化功能的影響，為進一步的臨床研究應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。清潔級同種系成年雄性Wistar大鼠，6周齡，體質量160～200 g，購自軍事醫學科學院動物中心。（2）主要試劑及儀器。內皮細胞基礎培養基及生長因子套裝（EBM-2 Basal Medium，美國Lonza公司）；淋巴細胞分離液（Histopaque 1083)、大鼠血漿來源玻連蛋白、FITC標記的荊豆凝集素1均購自美國Sigma公司；PE標記羊抗大鼠CD34流式抗體（美國Santa Cruz公司）；FITC標記兔抗大鼠CD133流式抗體(美國Bioss公司)；Dil-acLDL（美國molecular probes公司)；Annexin V/PI凋亡試劑盒、Matrigel（BD公司）；4,6-二氨基－2－苯基吲哚（DAPI，Roche公司)。CO2孵育箱（Thermo，美國），熒光倒置顯微鏡（Olympus IX71，日本），IN Cell analyzer 2000細胞成像系統（美國GE公司），流式細胞儀（美國BD FACS Calibur）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BM-EPCs的培養 氯胺酮（80 mg/kg）麻醉大鼠，脫頸處死，無菌條件下解剖出肱骨、脛骨、腓骨、股骨，于75%乙醇溶液中浸泡10 min，用預冷至4℃的PBS液反復沖洗骨髓腔至透亮，將濾液緩慢注入含有3 mL Histopaque 1083的15 mL離心管中，2 100 r/min離心，收集中層棕黃色單核細胞層至新離心管中，PBS液洗滌2次，加入4 mL氯化銨溶液，4℃孵育10 min，1 400 r/min離心15 min，2 mL EBM-2培養液重懸細胞，調整濃度為1×109個/L，接種至包被有玻連蛋白10 cm培養皿中，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。4 d后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，所有細胞均培養至第7天。

1.2.2 缺氧培養及分組 將培養至第4天的細胞分成常規培養組與缺氧培養組，常規培養組于37℃、5%CO2下繼續培養3 d，缺氧培養組分別于第4、5、6天、放入充滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養盒內，密閉培養盒，放入37℃培養箱內，每24 h重新充入新的1%O2+5%CO2+94%N2氣體3 min，繼續培養72、48、24 h，于第7天收集各組培養細胞，進行下一步研究。

1.2.3 內皮祖細胞表面標志物鑒定 0.25%胰酶/EDTA消化常規培養組細胞成單細胞懸液，PBS洗2次，光鏡下計數，PBS調整細胞濃度至1×109個/L，取100 μL單細胞懸液種植于96孔板中，37℃、5%CO2條件下過夜，每孔中均勻加入CD34-PE 2 μL、CD133-FITC 2 μL、37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌2次，棄上清，重懸，Cell analyzer 2000細胞成像系統下拍照，Image J軟件分析。

1.2.4 內皮祖細胞吞噬功能鑒定 將培養至第7天的細胞中加入1 mL完全培養基稀釋的10 mg/L Dil-acLDL，37℃溫箱孵化4 h后，PBS洗滌3次，2%甲醛室溫下固定20 min，再加入1 mL 10 mg/L FITC標記的荊豆凝集素1（FITC-UEA-1）室溫孵育1 h，PBS洗3次，最后加入1 mL完全培養基稀釋的10 mg/L DAPI于37℃溫箱育15 min，熒光顯微鏡下觀察DilacLDL和FITC-UEA-1雙陽性細胞。

1.2.5 內皮分化功能檢測 Matrigel 4℃過夜融化，分別將常規培養組及缺氧培養24、48、72 h組的細胞消化并制作成2×105個/mL的單細胞懸液，96孔板中，每孔板中均勻鋪置50 μL Matrigel后，37℃溫箱孵育30 min使其凝固，加100 μL單細胞懸液于Matrigel表面上，37℃孵育6～8 h，顯微鏡下觀察血管網狀結構，應用Wimasis image analysis軟件分析總的血管環數及血管長度。

1.2.6 Annexin V/PI抗凋亡檢測 收集常規培養組及缺氧培養24、48、72 h組細胞，冷PBS洗2次，1×Binding buffer重懸細胞，調整細胞濃度至1×109個/L，預設陰性對照、Annexin V、PI、Annexin V+PI各1管，每管中加入100 μL細胞懸液，分別加入 5 μL PBS、5 μL FITC-Annexin V、10 μL PI、5 μL FITCAnnexin V+10 μL PI，室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL 1×Binding buffer重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，計量數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BM-EPCs的形態觀察以及增殖情況 細胞接種時呈小圓形，48 h后可見細胞貼壁生長，未貼壁的細胞仍呈圓形、胞質透亮；4 d左右細胞增殖明顯，形成血島樣細胞集落，集落邊緣區以紡錘狀、梭形細胞為主，中央區多見多邊形細胞；常規培養組繼續培養至7～10 d左右，細胞集落漸消失，細胞體積變大,個別細胞呈線性排列，細胞呈典型紡錘狀，缺氧培養24 h組細胞形態較常規組變化不大，以梭形細胞為主缺氧培養48 h組細胞形態變化明顯，呈典型梭形、紡錘形缺氧培養72 h組細胞體積變大，較常規培養組粗短，形態變化更加明顯，見圖1。

Figure 1 The morphology of BM-EPCs in vitro culture圖1 體外培養BM-EPCs的形態學變化（×100）

2.2 BM-EPCs吞噬功能鑒定 結合Dil-acLDL的貼壁細胞呈紅色，結合FITC-UEA-1的細胞呈綠色，結合DAPI的細胞核呈藍色，雙陽性細胞呈黃色，表明其具有內皮祖細胞增殖特性，見圖2。

2.3 BM-EPCs表面標志物鑒定 結合CD34-PE的細胞發紅色熒光，結合CD133-FITC的細胞發綠色熒光，CD34+/CD133+雙陽性細胞為內皮祖細胞，見圖3。

2.4 缺氧對BM-EPCs早期凋亡的影響 常規培養組及缺氧24、48、72 h組BM-EPCs早期凋亡率分別為（0.89±0.20）%、（1.33±0.07）%、（3.25±0.12）%、（7.48±1.53）%，差異有統計學意義（F=44.738，P＜0.01），除常規培養組與缺氧24 h組無明顯差異外，其余組間兩兩比較差異均有統計學意義，隨缺氧時間的增加，細胞早期凋亡率明顯增加，見圖4。

2.5 缺氧對BM-EPCs體外血管形成能力的影響 見表1，圖5。4組細胞均具有血管形成能力，與常規培養組相比較，缺氧24 h組細胞體外血管形成能力增強，缺氧48、72 h組細胞體外血管形成能力減弱，差異有統計學意義。

Table 1 Comparison of the tube formation ability between four groups表1 各組體外血管形成能力比較 （n=6,ˉ± s）

Table 1 Comparison of the tube formation ability between four groups表1 各組體外血管形成能力比較 （n=6,ˉ± s）

＊＊P ＜0.01；a與常規培養組比較，b與缺氧24 h組比較,P＜0.05

組別常規培養組缺氧24 h組缺氧48 h組缺氧72 h組F血管管腔數目508.00±23.72 541.00±16.41a468.00±5.93ab332.00±17.02ab78.53＊＊血管長度（μm）8 6901.00±2 285.31 8 8311.00±3 206.15a8 1654.00±2 306.32ab6 3294.00±3 606.88ab144.68＊＊

Figure 4 The effect of hypoxic precondition on the early apoptosis of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(BM-EPCs)圖4 缺氧預處理對BM-EPCs早期凋亡的影響

Figure 5 The effects of different hypoxic precondition on the tube formation ability of bone marrow-derived endothelial progenitor cells in vitro(×40)圖5 缺氧對BM-EPCs體外血管形成能力的影響(×40)

3 討論

缺血損傷后的組織修復和再生包含局部循環選擇性重建和多向分化干細胞的遷移，EPCs在缺血損傷局部血管再生和循環重建中具有重要作用。EPCs主要存在于骨髓和外周血中，不同來源、不同分化階段的EPCs生物學功能不同，目前，對EPCs的鑒定主要根據外表型和生物學功能，CD133+/CD34+/KDR+、CD34+/CD133+等組合陽性標志物，被公認為鑒定和分選EPCs的主要外表型。骨髓中含有豐富的EPCs，正常情況下BM-EPCs逐步分化為成熟EPCs到外周血中，通過內皮化和新生血管化參與機體血管損傷修復和維持體內EPCs的內平衡[5]。

缺氧環境包含在正常生理過程中，同時也可能導致病理學反應。過度的缺氧會導致細胞的凋亡，但適度的低氧預刺激被認為具有明顯的細胞保護作用，如缺氧微環境可以明顯增強EPCs的遷移、抗凋亡及血管生成能力。分析其可能的機制有以下2個方面：（1）缺氧條件下HIF-1α穩定性增強，促進HIF-1與低氧反應元件（hypoxia response element,HRE）的結合，進一步誘導低氧靶基因的激活，上調與血管系統相關的因子蛋白表達，如血管內皮因子（VEGF）、基質細胞衍生因子-1等，研究表明，低氧環境下，細胞表達血管內皮因子明顯增強，VEGF可以明顯促進幼稚干細胞向成熟內皮細胞分化，內皮細胞新生血管能力明顯增強[6]。（2）缺氧條件下，HIF-1α激動PI3K/AKT信號通路，增強下游信號分子蛋白表達，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化失活、細胞核因子-κB（NF-κB）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等，增強細胞遷移、抗凋亡能力[7-8]。但是，缺氧預處理對BM-EPCs生物學功能影響的最佳時間條件不甚明確。

干細胞移植治療缺血性心肌病已經成為研究熱點，但提高移植后的干細胞在動物模型體內的存活率是難點之一。本研究旨在通過體外缺氧預處理BM-EPCs，探索增強BM-EPCs的生物學功能又不增加細胞凋亡的缺氧時間點，為后續的動物移植選擇合適的種子細胞，研究結果表明，隨著缺氧時間的延長，BM-EPCs的早期凋亡率明顯增加，提示長時間的缺氧刺激顯著促進細胞凋亡。與常規培養組相比,缺氧培養24 h組早期凋亡率增加不明顯,而體外血管形成能力明顯強于常規培養組及缺氧48、72 h組，差異均有統計學意義，可見，缺氧預處理24 h對BM-EPCs具有細胞保護作用。本研究還存在一些不足，今后將對更短時間的缺氧預處理以及不同氧濃度的預處理進行更加深入的探討。

Figure 2 The identification of BM-EPCs by the adsorption ofDiI-acLDL and the binding of FITC-UEA-1圖2 BM-EPCs吞噬功能鑒定（×400）

Figure 3 The identification of BM-EPCs by the cell surface markers圖3 BM-EPCs細胞表面抗原鑒定(×40)

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（2013-10-10收稿 2013-11-29修回）

（本文編輯 李國琪）

The Effect of Hypoxic Preconditioning on the Biological Function of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cells

XUE Fenlong1,CHEN Qingliang2,JIAN Kaitao2,LIU Jianshi2,GUO Zhigang2，JIANG Nan2
1 Postgradulate College of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Cardiac Surgery,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate the effect of hypoxic preconditioning on the biological function of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(BM-EPCs).MethodsMononuclear cells were collected by density gradient centrifugation from the bone marrow of rats.The isolated cells were cultivated in dishes coated with the vitronectin from rat plasma，filled with the endothelial cell basal medium-2.Cells were then cultured under the conventional culture conditions(37℃and 5%CO2).The cultured cells were divided into control group and hypoxia training group after four-day culture.Cells of the control group were cultured in previous conditions for another three days.However,cells of the hypoxia training groups were cultured in previous conditions for 0,1 and 2 days，and then under the hypoxic condition(1%O2+5%CO2+94%N2)for another 72 hours,48 hours and 24 hours,respectively.After seven days，cells in all of groups were collected for the following study.The immunofluorescence labeling and cell analyzer were used to indentify BM-EPCs.The tube formation of BM-EPCs was tested by Matrigel assay.Annexin V/PI antiapoptotic assay was used to detect the apoptotic rate of BM-EPCs.ResultsThe early apoptotic rate of BM-EPCs was increased obviously with extended hypoxia.There was no significant difference in the early apoptotic rate of BM-EPCs between control group(0.89±0.20)%and hypoxic 24-h group(1.33±0.07)%(P ＞0.05).There was significant increase in the early apoptotic rate of BM-EPCs in hypoxic 48-h group(3.25±0.12)%and hypoxic 72-h group(7.48±1.53)%(P ＜0.05).Compare with control group,the tube formation ability was significantly increased in hypoxic 24-h group(P＜0.01),but the tube formation ability was significantly decreased in hypoxic 48-h group and hypoxic 72-h group(P＜0.01).ConclusionAfter hypoxic preconditioning for 24 hours,the apoptotic rate was not obvious in BM-EPCs,but the tube formation ability was markedly increased.

stem cells;endothelial cells;anoxia;neovascularization,physiologic;apoptosis;rats,Wistar;bone marrow-derived endothelial progenitor cells

R738.1 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.012

*天津市自然科學基金資助項目（項目編號：12JCYBJC33100）

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）;2天津市胸科醫院心外科

△通訊作者 E-mail：wavejiankt@hotmail.com