洛伐他汀聯合降鈣素治療骨質疏松大鼠骨折的效果分析

曹國龍 劉小坡 馮云波 田發明

洛伐他汀聯合降鈣素治療骨質疏松大鼠骨折的效果分析

曹國龍1劉小坡1馮云波1田發明2△

目的探討洛伐他汀單獨或聯合降鈣素對骨質疏松大鼠骨折愈合的影響。方法4月齡雌性SD大鼠40只，隨機分為正常骨折（A）組、骨質疏松性骨折（B）組、洛伐他汀治療（C）組、降鈣素治療（D）組和聯合治療（E）組，每組8只。A組行假手術，B、C、D、E組行雙側卵巢摘除術，術后8周制作股骨干骨折模型，骨折后8周處死大鼠。采用ELISA法檢測血Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP），X線攝片及評分觀察骨折愈合情況，骨密度檢測骨折側股骨骨密度，生物力學分析骨折側股骨最大載荷。結果（1）血清PINP水平：A組顯著低于其余各組，C、E組顯著高于B組，D組顯著低于C組。（2）X線示A、E組愈合良好，B組多數標本可見模糊骨折線，C、D組略好于B組。評分結果：A、E組顯著高于B、C、D組。（3）骨密度：股骨全長及中段骨密度A組最高，E、D、C組次之，B組最小。（4）最大載荷：A組大鼠骨折側股骨最大載荷顯著高于其余4組，E組顯著高于B組。結論骨質疏松大鼠骨量下降、骨折愈合進程延遲，洛伐他汀聯合降鈣素較單獨應用可更有效地抑制骨質疏松大鼠骨量的丟失并促進骨折的愈合。

骨質疏松；骨折；洛伐他汀；降鈣素；骨密度；疾病模型,動物

隨著人口老齡化的逐步加劇，骨質疏松及骨質疏松性骨折已成為威脅中老年人群健康的主要社會公共健康問題之一。目前臨床廣泛應用的包括降鈣素在內的骨質疏松治療藥物多為骨吸收抑制劑，對骨折愈合的作用尚存爭議[1]。1999年Mundy等[2]首次發現洛伐他汀具有成骨作用潛能，此后諸多學者對此進行了深入研究，并進一步證實了洛伐他汀的成骨作用[3-4]，但對骨質疏松性骨折的治療效果鮮見報道，且有研究顯示他汀類藥物單獨系統性給藥的成骨作用有限[5]。本研究擬通過建立骨質疏松性骨折模型，同時給予洛伐他汀和降鈣素單獨或聯合應用，綜合分析洛伐他汀聯合降鈣素應用對骨質疏松性骨折大鼠骨代謝、骨折愈合的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4月齡雌性SD大鼠40只，清潔級，體質量（270±25）g，購自北京維通利華實驗動物養殖中心[動物合格證號SCXK（京）2009-0004號]。

1.2 主要試劑和儀器 洛伐他汀（Lovastatin，商品名：美降之，浙江瑞邦藥業有限公司），鮭魚降鈣素（商品名：密蓋息，瑞士諾華公司），ELISA試劑盒（上海史瑞可生物科技有限公司），Norland-XR 36雙能X線骨密度測量儀（美國DEXA公司），X線攝像儀（美國通用公司）。

1.3 動物分組及處理 所有大鼠采用隨機數字表法隨機分為5組：正常骨折（A）組、骨質疏松性骨折（B）組、洛伐他汀治療（C）組、降鈣素治療（D）組和洛伐他汀與降鈣素聯合治療（E）組，每組8只。A組行假手術。B、C、D、E組行雙側卵巢摘除術：采用1%戊巴比妥鈉以40 mg/kg腹腔注射麻醉，背側入路，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm處取縱行切口，長約1 cm，暴露腹腔卵巢并予以切除后，以絲線將殘端結扎，逐層關閉傷口。術后8周所有大鼠制作股骨干骨折模型。A組不予干預；B組按2 mL/kg給予生理鹽水灌胃；C組給予洛伐他汀20 mg/kg溶于生理鹽水（40 g/L）中灌胃；D組給予降鈣素10 IU/kg，皮下注射；E組給予洛伐他汀和降鈣素（按C、D組劑量）聯合干預，均每天1次。骨折后8周處死大鼠。

1.4 檢測指標

1.4.1 血Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP）水平的測定 所有大鼠處死前留取24 h尿液，再分別抽取外周血2 mL，采用ELISA法檢測血PINP值。

1.4.2 計算機X線攝像儀（CR）攝片 將大鼠完整的右側股骨干骨折標本經CR攝片（距離90 cm，電壓40 kV、電流3.2 mA），觀察大鼠股骨骨折骨痂的連續性及骨折愈合情況[2]。CR攝片評分標準：0分，骨折線清晰可見，無明顯骨膜反應；1分，骨折斷端邊緣趨向模糊，骨膜輕度反應，無骨痂可見；2分，斷端邊緣模糊，骨膜反應淺淡，骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊；3分，斷端邊緣仍可見，但接近消失，骨膜反應較深，骨痂量增多，但尚未填滿缺損，密度增深，邊緣較清；4分，斷端邊緣完全消失，骨膜反應密度近似骨影，骨痂填滿缺損，與骨皮質密度相同并相互連接。每張片均由3名骨科醫生分別評分，取平均值。如評分醫師認為愈合情況介于兩種分級之間，可以0.1分為打分單位。

1.4.3 骨密度的測量 應用Norland-XR36 DEXA，采用小物體掃描模式，準確度0.01%，掃描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描寬度5.0 cm，進行右側股骨骨密度的測量。測量時，將固定骨折部位的克氏針拔除，依據骨密度測量儀實際掃描測量的股骨長度，分別測量整體骨密度（tBMD）和中段（中1/2）骨密度（mBMD）。

1.4.4 三點彎曲實驗 取所有大鼠的右側股骨行三點彎曲實驗，支點跨距（L）為20 mm，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率10 mm/min，在軟件里直接得到最大載荷（FM）。

1.5 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件進行處理，數據采用均數±標準差（±s）表示，利用單因素方差分析比較各組均數間的差異，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA檢測結果 B、C、D、E組血清PINP高于A組，C、E組顯著高于B組，D組低于C組，E組高于D組，其余組間PINP差異無統計學意義，見表1。

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各組大鼠PINP、BMD、FM及X線評分結果（n=8±s）

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各組大鼠PINP、BMD、FM及X線評分結果（n=8±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F PINP（mg/L）0.142±0.039 0.286±0.057a0.304±0.043ab0.281±0.040ac0.325±0.045abcd1 486.462＊＊tBMD（g/cm2）0.218±0.015 0.161±0.017a0.175±0.012ab0.181±0.011abc0.190±0.016abcd1 314.078＊＊組別A組B組C組D組E組F mBMD（g/cm2）0.206±0.014 0.150±0.012a0.171±0.010ab0.174±0.020abc0.183±0.015acbd1 177.430＊＊FM（N）78.62±12.37 38.60±9.46a49.10±16.71a49.60±12.58a57.50±13.92ab7.654＊＊X線評分4.95±0.67 2.63±0.39a3.19±0.36a3.13±0.35a4.08±0.45abcd19.612＊＊

2.2 骨密度檢測結果 不同組間股骨tBMD及mBMD差異均有統計學意義，表現為A組最高，E、D、C組次之，B組最低，見表1。

2.3 生物力學檢測結果 A組大鼠骨折側股骨FM高于其余4組，E組高于B組，其余組間FM差別無統計學意義，見表1。

2.4 X線檢查結果 A組大鼠骨折愈合較好，多數標本骨折線消失；B組愈合顯著延遲，骨折線仍可見，骨痂密度較淡，仍明顯低于正常骨組織；C、D組略好于B組；E組較B組改善明顯，個別標本愈合情況良好，斷端邊緣模糊，甚至接近消失，見圖1。X線評分結果顯示A、E組高于B、C、D組，且A組高于E組，其余組間差別無統計學意義，見表1。

3 討論

3.1 骨質疏松對骨折愈合的影響 骨質疏松對骨折愈合的不利影響已屢有報道[6-7]。骨折愈合進程大致分為血腫機化演進期、原始骨痂形成期、骨痂塑形改造期，即一般所說的早、中、晚期。本研究選擇6月齡大鼠骨折后8周為觀測時間點，正常大鼠大致處于骨痂塑形或更成熟階段，但影像學分析和生物力學檢測結果均提示骨質疏松大鼠骨痂仍未成熟，也再次證實了在去卵巢建立的大鼠骨質疏松骨折模型中，不僅骨密度顯著降低，骨折愈合進程較正常大鼠明顯延遲。

Figure 1 Results of X-ray film in five groups of model rats圖1 各組模型X線檢測結果

3.2 聯合用藥與單獨用藥效果比較 諸多研究證實部分他汀類藥物包括辛伐他汀和洛伐他汀具有成骨作用潛能，尤以體外研究為著[3,8]。體內研究中對他汀類藥物的成骨作用尚未達成一致結論，局部用藥尤其是復合他汀類藥物的生物緩釋材料成骨效果顯著[9]，但系統性給藥到達骨組織的藥物濃度過低，成骨效果受限[5]。然而系統給藥具有對骨折局部干預少、實施方便易行等優點。聯合用藥為解決這一問題提供了新的思路[10]，因此本研究采用洛伐他汀與骨吸收抑制劑聯合應用，探討藥物在抑制骨吸收的基礎上充分發揮其促骨形成的作用。降鈣素作為臨床治療骨質疏松的一線藥物，其對骨折愈合的不良反應尚鮮見報道，因此本研究選擇降鈣素作為聯合藥物。結果證實，雖然單獨用藥組對骨密度的維持及骨折愈合均有一定的積極作用，但效果不及聯合用藥明顯，洛伐他汀與降鈣素聯合用藥不僅更大限度地維持了骨質疏松大鼠的骨量，還在此基礎上促進了骨質疏松大鼠骨折的愈合，改善其力學性能。

3.3 生化指標檢測結果及分析 外周血中特異性生化標志物的檢測有助于分析藥物干預后大鼠骨代謝狀態的改變，作為反映骨形成活躍程度的血清骨代謝指標PINP檢測結果顯示，正常大鼠骨形成狀態反而更低，其原因可能為：模擬絕經后骨質疏松大鼠的骨轉換水平明顯增高，即骨吸收與骨形成活性同時增加，而對于不存在高骨吸收活性的正常大鼠，其正常骨形成能力足以保證骨折的順利愈合。洛伐他汀單獨或聯合降鈣素應用后PINP的血清學水平均顯著高于B組，可能與洛伐他汀刺激骨形成的作用有關，具體原因尚有待進一步研究證實。

[1]McDonald MM,Dulai S,Godfrey C,et al.Bolus or weekly zoledronic acid administration does not delay endochondral fracture repair but weekly dosing enhances delays in hard callus remodeling[J].Bone,2008,43(4):653-662.

[2]Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J].Science,1999,286(5446):1946-1949.

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（2013-06-17收稿 2013-10-08修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effect of Lovastatin Combined with Calcitonin on Fracture Repair in Osteoporotic Rats

CAO Guolong1,LIU Xiaopo1,FENG Yunbo1,TIAN Faming2
1 Department of Orthopedic Surgery of Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China;2 Medical Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo investigate the effects of lovastatin alone or combined with calcitonin on fracture repair in osteoporotic rats.MethodsForty 4-month-old female SD rats were randomized into 5 groups（8 rats in each group）:normal fractured group(A),osteoporotic fractured group(B),lovastatin treatment group(C),calcitonin treatment group(D)and lovastatin combined with calcitonin treatment group.All rats except group A

bilateral ovariectomy.The midshaft femur fracture model was established in all rats 8 weeks after operation.The serum level of procollagen amino-terminal propeptide(PINP)was assessed by ELISA.X-ray and bone mineral density detection was used to observe the fracture healing process.The maximal loading of femoral fractures was analyzed by biomechanical method.Results(1)The serum level of PINP was significantly lower in group A than that of other groups.There was a significantly higher level of PINP in group C and group E than that of group B,and the level of PINP was significantly lower in group D than that of group C.(2)The X-ray showed more progressed fracture healing in group A and group E.The accordingly score indicated that there was a markedly higher score in groups A and group E compared to that of other three groups.(3)There was a highest bone mineral density in the full-length and in the middle of femur bone in group A,followed by group E,group D and group C.The lowest bone mineral density was found in group B.(4)The biomechanical test showed that the maximal loading in femur fracture side was significantly higher in group A than that of other four groups,in which it was higher in group E than that of group B.ConclusionThe osteoporosis decreased bone mass and delayed fracture healing process in rat model.The treatment of lovastatin combined with calcitonin showed more positive effect on preventing bone loss and promoting fracture repair than lovastatin alone.

osteoporosis；fractures,bone；lovastatin；calcitonin；bone density；disease models,animal

R683 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.014

1唐山市工人醫院骨外科（郵編063000）；2河北聯合大學醫學實驗研究中心

△通訊作者 E-mail：tfm9911316@163.com