不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達及血清炎性因子的影響

石秋艷，張瑞彪，田廣平

論著·基礎

不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達及血清炎性因子的影響

石秋艷，張瑞彪，田廣平

目的探討不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠脊髓內NF-κB表達及血清炎性因子的影響。方法82只Wistar大鼠隨機抽取10只為健康對照組，余72只以50%豚鼠全脊髓勻漿誘發建立EAE 模型，而后隨機分為EAE模型組、大劑量阿托伐他汀組(大劑量組)、小劑量阿托伐他汀組(小劑量組)各24只，采用量化評分法，比較造模后14d、21d不同劑量阿托伐他汀鈣對 EAE大鼠血清白介素-2(IL-2)、同型半胱氨酸(Hcy)及脊髓內核轉錄因子-κB (NF-κB)水平的影響，同時對其發病率及潛伏期進行比較。結果造模后高劑量組發病率及病死率明顯低于低劑量組及EAE模型組，14d及21d時神經功能評分均低于低劑量組及EAE模型組(P<0.05)，而低劑量組與EAE模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。造模后14d及21d，EAE模型組血清IL-2、Hcy水平及脊髓NF-kB陽性表達水平均較健康對照組升高(P<0.05)，高劑量組低于低劑量組與EAE模型組(P<0.05)，而低劑量組與EAE模型組差異無統計學意義(P>0.05)。21d時，高劑量組、低劑量組、EAE模型組上述各項指標均較14d時下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結論高劑量阿托伐他汀鈣能降低大鼠EAE的發病率及病情嚴重程度，可能與其抗炎及免疫調節機制有關。

腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性；NF-κB；炎性因子；阿托伐他汀鈣；大鼠

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)于1868 年由法國醫生 Charcot首次提出，至今仍是整個醫學界未解的難題之一。MS 的主要病理特征為自身免疫炎性反應所致的髓鞘脫失和軸突損傷等，特別是在發病早期發生的軸突變性及神經元損傷是 MS 患者神經功能障礙的重要原因。現就阿托伐他汀鈣對MS的經典動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE) 脊髓內NF-κB表達及血清炎性因子水平影響的觀測，探討 MS 的發病機制，尋求針對 MS 有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性Wistar大鼠82只， 7～8周齡，體質量160～200g，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。豚鼠10只，雌雄各半，24～36周齡，體質量360～380g，清潔級，由溫州醫學院實驗動物中心提供。試劑：白介素-2(IL-2)、同型半胱氨酸(Hcy)試劑盒購自上海天呈生物技術有限公司。兔抗大鼠NF-κB 抗體及二步免疫組化檢測試劑盒購于北京博奧森生物技術公司。完全福氏佐劑購于美國 Sigma 公司；卡介苗購于北京生物制品研究所；阿托伐他汀鈣由大連輝瑞制藥有限公司提供。

1.2 實驗方法 豚鼠全脊髓勻漿參照文獻[1]方法制備，經10%水合氯醛3～5 ml腹腔注射麻醉處死后，冰上迅速剝除脊膜，取出脊髓，按1∶1比例加入等量0.9%氯化鈉用超聲細胞粉碎儀在冰槽中制成50%的全脊髓勻漿，與等量含0.4g/100ml卡介苗的完全福氏佐劑混合充分至油包水乳劑；隨機抽取10只大鼠作為健康對照組，其余大鼠經上述試劑乳化后按0.8 ml/只4h內注射于大鼠雙后足墊內皮下誘導建立EAE模型，并隨機分成3組，即EAE模型組、低劑量阿托伐他汀組(低劑量組)、高劑量阿托伐他汀組(高劑量組)，每組24只，免疫后當日高劑量組予阿托伐他汀鈣8 mg/kg 灌胃治療，低劑量組予阿托伐他汀鈣3mg/kg 灌胃治療，EAE模型組及健康對照組給予生理鹽水灌胃，每日1次持續至動物處死。5分評分法評分≥1分為造模成功。大鼠于造模成功后第14、21天以10%水合氯醛3～5 ml腹腔麻醉后每組各取12只斷頭處死，取脊髓，常規石蠟封片包埋，每25 μm間斷性連續切片，同時予以常規HE染色；同時心臟采血2 ml，離心后獲取血清，-70℃冰箱保存。

1.3 觀測指標

1.3.1 動物行為學觀察和神經癥狀評分：觀察大鼠臨床表現及行為。模型評分采用5分評分法：1分：動物尾部無力下垂或無力挺立；2分：后肢無力；3分：后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態或死亡。

1.3.2 血清炎性因子水平及NF-κB陽性表達情況：血清IL-2、Hcy測定采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法。試劑盒購自上海天呈生物技術有限公司，嚴格按照試劑盒說明進行測定。NF-κB陽性細胞采用免疫組化法檢測，嚴格按照試劑盒說明操作，同時設陰性對照。取大鼠腰髓切片在顯微鏡下計數每張片內隨機5個高倍視野(×400) NF-κB陽性細胞數，NF-κB的表達以該片陽性細胞數總和/5表示，取10片平均值。

2 結 果

2.1 動物發病情況及神經癥狀評分 健康對照組大鼠無發病，活動度正常。其余3組8～15 d發病，發病后3～8 d可有緩解，部分癥狀持續進展，少數緩解后復發，部分大鼠死亡。各組比較，高劑量組發病率及病死率明顯低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)，同日神經功能評分明顯低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)，而發病率、病死率及神經功能評分低劑量組與EAE模型組比較差異無統計學意義(P﹥0.05)。見表1。

2.2 血清炎性因子水平及NF-κB陽性表達情況比較 免疫大鼠發病后14～21d血清IL-2及Hcy均高于健康對照組(P<0.05)，發病21d后上述炎性因子較14d時有所降低(P均<0.05)，其中2個時間段高劑量組均低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)。大鼠于免疫14d后NF-κB 陽性細胞明顯增多，呈彌漫性分布，多見于白質、灰白質交界處及血管“袖套”處，隨著病程的延長，到21d陽性細胞數又逐漸減少(P<0.05)(圖1、2見封3)。高劑量組大鼠在免疫后14d和21d，NF-κB 細胞數明顯低于EAE模型組及低劑量組(P均<0.05)。而低劑量組與EAE模型組差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組Wistar大鼠 EAE發病情況及其神經癥狀評分

注：與EAE模型組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05

表2 各組Wistar大鼠不同時間段血清炎性因子水平及NF-κB表達情況

注：與健康對照組比較,*P<0.05；與EAE模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與14d比較,☆P<0.05

3 討 論

MS是一類主要由T細胞介導的自身免疫性疾病，T細胞針對中樞神經髓鞘成分的抗原抗體反應在MS的發病過程中起到了關鍵的作用。其主要發病機制是某種外部因素作用下激活的T細胞透過血腦屏障進入到腦組織，結合中樞的抗原形成細胞抗原，再刺激T細胞分泌出大量的炎性細胞因子，促使B細胞和巨噬細胞的活化，進一步使外周血中的T淋巴細胞、單核細胞以及B淋巴細胞等進入到炎性反應部位，從而導致中樞神經軸索的損害以及神經組織的炎性脫髓鞘反應[2]。在這些炎性細胞因子中，比較有代表性的是白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)及同型半胱氨酸(Hcy)等，目前研究證實 Hcy作為炎性細胞因子，不但與動脈硬化密切相關，而且嚴重影響著患者的認知功能[3，4]。意大利精神病學家對一個大樣本健康老年人的研究發現，隨著Hcy水平的升高，簡易精神狀況檢查評分逐漸降低，Hcy成為認知功能損害的獨立危險因素[5]，而IL-2是T細胞介導的炎性反應中重要一環，由Th1類細胞分泌，在炎性反應啟動過程中有著至關重要作用，因此，我們從中挑選IL-2及Hcy作為其中代表性的因子，探討這些炎性因子在多發性硬化發病過程中的水平變化。同時探討阿托伐他汀鈣對神經細胞的保護作用及對血清炎性因子水平的影響。

凌振芬等[6]研究證明，抗氧化藥物α硫辛酸能顯著改善EAE大鼠的神經功能，其機制可能與抗炎及免疫調節有關。歷芳等[7]研究表明，阿米洛利能夠減緩小鼠EAE病情，其機制可能與下調中樞神經系統IL-17和IFN的表達，上調IL-10的表達有關。近年來關于他汀類藥物抗炎及抗氧化的作用日益受到醫學界的重視[8]，同時，其對于多發性硬化的干預作用時見報道[9～11]。阿托伐他汀作為他汀類藥物中最有效的調脂藥物之一，能有效地控制動脈硬化斑塊的形成及進展，并能使不穩定斑塊轉變為穩定性斑塊。近年來發現它具有抗炎及雙向免疫調節作用，他汀類藥物的抗炎作用可能是通過抑制 HMG-CoA還原酶，阻斷類異戊二烯中間代謝產物的生成，進而阻斷Ras、Rho、Rac 等蛋白的異戊二烯化，調節 Thl /Th2平衡，影響細胞的增殖、分化和遷移作用[12]。Neuhaus 等[13]研究證實，他汀類藥物可劑量依賴性地抑制活化 T 細胞的增殖，減少 T細胞上黏附分子的表達，有效下調 B 細胞、T 細胞上趨化因子受體。本結果發現高劑量組與低劑量組及 EAE模型組相比MS發病日期后延，神經系統評分有明顯下降，病理檢查所示病灶數也顯著減少，同時血清炎性因子水平明顯降低，顯示高劑量阿托伐他汀具有干預治療大鼠 EAE 的作用。造模成功大鼠于14d后脊髓內 NF-κB陽性細胞大量活化，而高劑量組NF-κB 陽性細胞明顯減少，其臨床癥狀也較 EAE模型組及低劑量組減輕，這說明了阿托伐他汀可能抑制了 NF-κB 陽性細胞增殖活化，從而減輕了炎性反應。NF-κB 作為一個核轉錄因子，具有多種功能，其在炎性反應中起重要作用。他汀類藥物通過抑制Th0細胞向 Thl 細胞分化，減少 Thl 類細胞因子(IL-2、IFN-γ等) 的分泌，同時增加Th2類因子(IL-4、IL5、IL10等)的分泌，雙向調節免疫反應[14]，因此利于疾病的恢復。有研究證明[15]，阿托伐他汀促進星形膠質細胞的增殖，進而產生多種抗炎性細胞因子，通過這些抗炎因子的保護作用，能有效減低神經髓鞘的損傷，從而減輕臨床癥狀，有利于 EAE 的恢復。因此，筆者認為阿托伐他汀減輕 EAE 的臨床癥狀和病理改變，可能與其對于血清炎性因子水平的影響，即抗炎作用有關。

總之，阿托伐他汀可降低大鼠脊髓內 NF-κB 陽性細胞數及血清IL-2、Hcy等炎性因子水平，提示抗炎治療在EAE治療中的重要作用，為尋求更有效治療多發性硬化的藥物開辟了新的路徑。

1 徐玉，劉瑞春，王穎，等．Wistar大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立 [J]．腦與神經疾病雜志，2007，15(6)：415-418.

2 吳彥青，高穎，朱陵群.實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經組織中ZO-1mRNA的變化及益腎達絡飲對其的影響[J].中國中醫急癥,2012，21(12)：1936-1938.

3 Kittner SJ，Giles WH，Macko RF，et al．Homocysteine andrisk of cerebral infarction in a biralial population：the stroke prevention in young women study[J]．Stroke，1999,30(8):1554-1560．

4 石秋艷，張瑞彪，張啟增,等，血清幽門螺桿菌IgG及同型半胱氨酸水平與老年血管性癡呆及腦梗死的關系[J].第二軍醫大學學報,2008,29(2):230-231.

5 Ravaglia G，Forti P，Maioli F，et al．Homocysteine andcognitive function in healthy elderly community dwellers in Italy[J]．Am J Clin Nutr, 2003，77(3)：668-673．

6 凌振芬，趙永波，徐新蕾，α-硫辛酸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠模型干預的初步研究[J].上海醫學，2010，33(1):78-80.

7 厲芳，鄭榮遠，張正學.阿米洛利對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經系統中細胞因子表達的影響[J].中國臨床神經科學，2012，20(2)：121-125.

8 陳曦,鄭毅.他汀類藥抗炎和免疫調節作用的研究進展[J].中華風濕病學雜志，2007,11(8):499-502.

9 鄧艷，張旭.他汀類藥物在多發性硬化治療中的研究進展[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2008，15(2):112-115.

10 田廣平,石秋艷,王淑歌.阿托伐他汀對EAE大鼠脊髓ICAM-1和TGF-β1表達的影響[J].中華神經醫學雜志，2011,10(10):979-983.

11 林述凱，石秋艷，王淑歌,等.阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達的影響[J].吉林大學學報：醫學版,2011，37(4):607-611.

12 Beutler B． Inferences，questions andpossibilities in Toll-like recep-tor signaling[J]． Nature，2004，430(6996): 257-263.

13 Neuhaus O, Strasser-Fuchs S, Fazekas F, et al. Statins as immunomodulators : comparison with interferon-beta 1b in MS[J].Neurology, 2002, 59:990-997.

14 鄧艷，張旭.他汀類藥物在多發性硬化治療中的研究進展[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2008，15(2)：112-115.

15 王淑歌，林述凱，石秋艷,等. 阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的影響[J].安徽醫科大學學報，2011,46(10)：997-1000.

InfluenceofatorvastatincalciumontheexpressionofspinalcordNF-κBandseruminflammatoryfactorsinexperimentalautoimmuneencephalomyelitisrats

SHIQiuyan*,ZHANGRuibiao,TIANGuangping.

*DepartmentofSevereNeurology,AffiliatedHospitaltoHebeiUnionUniversity,Tangshan063000,China

ObjectiveTo detect the influence of different doses of atorvastatin calcium on spinal cordnuclear factor kappa B (NF-κB) expression andserum inflammatory factors levels in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats.MethodsTen of 82 Wistar rats were sampledas healthy control group,the other 72 rats were inducedEAE model by 50% guinea pig spinal cordhomogenate, then dividedinto EAE model group,high-dose atorvastatin group(high-dose group),low-dose atorvastatin group(low-dose group),with 24rats in each group, using quantitative evaluation methodcompareddifferent doses of atorvastatin calcium on serum inflammatory factors in rats with EAE,including interleukin -2(IL-2), homocysteine(Hcy) andNF-κB level of the spinal cord, andcomparedthe incidence andincubation period.ResultsAfter EAE model was established,the incidence andmortality rate of high-dose group was obviously lower than low-dose group andEAE group,andthe neural function score was lower than low-dose group andEAE group at 14dand21d(P<0.05),but there was no difference between low-dose group andEAE group (P>0.05). 14dand21dafter modeling,the serum IL-2,Hcy andspinal cordNF-κB expression level in EAE group were elevatedthan healty control group(P<0.05),high-dose group was lower than low-dose group andEAE group(P<0.05), but there was no difference between low-dose group andEAE group(P>0.05).Comparedwith 14d,all above indexes in high-dose group,low-dose group andEAE group in 21dwere obviously declined(P<0.05).ConclusionHigh-dose atorvastatin calcium can reduce the incidence andseverity of EAE rats,it may be relatedto anti-inflammatory andimmune regulation mechanism.

Encephalomyelitis,autoimmune,experimental；Nuclear factor kappa B；Inflammatory factors；Atorvastatin calcium;Rats

河北省醫學科學研究重點項目計劃(No.20100473)

063000 唐山，河北聯合大學附屬醫院重癥神經科(石秋艷)；063200 唐山市曹妃甸區醫院神經內分泌科(張瑞彪)； 066600 昌黎，秦皇島市第二人民醫院神經內科(田廣平)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.01.025

2013-09-10)