響應面法優化黑木耳多糖與三價鉻螯合工藝

尹紅力， 王振宇,2*， 梁薇薇， 李婷婷， 劉 冉， 張乃珣

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150090)

響應面法優化黑木耳多糖與三價鉻螯合工藝

尹紅力1， 王振宇1,2*， 梁薇薇1， 李婷婷1， 劉 冉1， 張乃珣1

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150090)

[目的]優化黑木耳多糖和三價鉻螯合工藝。[方法]采用分光光度法考察黑木耳多糖與三價鉻的質量比、螯合時間、三價鉻的初始濃度3個因素對其螯合率的影響，并通過Box-Behnken試驗設計對試驗數據進行二次響應面分析，優化黑木耳多糖與三價鉻的螯合工藝。[結果]試驗表明，木耳多糖與三價鉻的最佳螯合工藝條件為：木耳多糖與三價鉻的質量比為2.2∶1，螯合時間6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml，在該條件下螯合率為41.56%。[結論]應用響應面法所得到的黑木耳多糖-鉻(Ⅲ)螯合物的合成工藝參數是可行的，可為黑木耳多糖與三價鉻螯合物的進一步開發利用提供參考。

黑木耳多糖；三價鉻；螯合；響應面法

多糖(polysaccharide，簡稱PS)是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質，目前已有300多種多糖類化合物從天然產物中被分離[1]。研究表明，黑木耳多糖具有許多重要的生理功能，如：降血糖[2-3]、降血脂[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗衰老[8]、提高機體免疫等功能。鉻是目前研究較多且結論較為一致的一種重要的微量元素[9]，人體缺鉻會導致一系列的代謝失常及病變[10-11]。大量研究表明，微量元素鉻在糖尿病診斷、治療及預防中有重要的作用[12-13]。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病成為危害人類健康的一大疾病，且發病率逐年上升，引起人們的廣泛關注[14]。研究表明，多糖與金屬離子的螯合物具有某些特殊的生理生化功能[15-16]，多糖螯合物不僅能夠發揮黑木耳多糖的強大生理功能，同時能夠作為一種金屬補充劑，有降血糖[17]、補血、補鋅等功效。目前已經報道了黑木耳多糖與Fe(Ⅱ)、Ze、Ag等螯合物的制備工藝[18-20]。鉻在可食用領域的研究多數以蛋白質、多肽與鉻螯合為主，少有多糖與鉻進行螯合的相關報道[21]，筆者以東北地道黑木耳作為原料提取黑木耳多糖，充分發揮資源優勢，并且與鉻螯合，通過考察影響其螯合率的主要因素，并應用響應面法獲得最佳提取工藝，為其在食品、醫藥、保健品等方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 黑木耳，黑龍江省海林市北味黑木耳。主要試劑：無水乙醇、氯化鉻、硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉，均為分析純。主要儀器：恒溫水浴鍋， 上海普渡生化科技有限公司；精密pH計，廣州三贏儀器公司；DHG-9240鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；UT-1810PC紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；JA2003電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；PC20E-G電磁爐，上海奔騰企業有限公司；721分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BCD-202GNS(E) 三星電冰箱，三星電器有限公司；RE-5205旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；TDL-40B-W臺式低速大容量離心機，河南星科科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取方法。原料預處理→熱水浴浸提(料液比1∶50 g/ml、提取溫度為80 ℃、提取時間4 h)→離心(4 000 r/min，10 min)→上清液抽濾→濃縮→脫色→Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage試劑∶多糖溶液=1∶4)→醇沉過夜→離心→透析→凍干→多糖粗品。

1.2.2 三價鉻溶液的配制。氯化鉻溶液，分別稱取2.562、3.074、3.587 g氯化鉻分別溶于少量水中，移入100 ml容量瓶，加蒸餾水定容至100 ml，搖勻，分別配成5、6、7 mg/ml的三價鉻溶液，儲存于棕色瓶放置在冰箱中待用。磷酸溶液的配制：磷酸與水體積比是1∶3。

1.2.3 黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成與螯合率的測定。準確稱取一定量的黑木耳多糖，加入待螯合的Cr(Ⅲ)溶液，置于振蕩培養箱中，25 ℃，150 r/min，醇沉取上清液，旋轉蒸發儀旋出乙醇，移取旋完后的上清液10 ml于25 ml錐形瓶中，加入5 ml磷酸，蒸餾水定容，分光光度計測量OD值，計算Cr(Ⅲ)的質量濃度。試驗中的pH用稀硫酸或稀氫氧化鈉調節[22]。

螯合率的計算公式：A(%)=(m0-m)/m0×100%

式中：A表示螯合率，m0表示螯合前溶液中Cr(Ⅲ)的質量(g)，m表示螯合后溶液中Cr(Ⅲ)的質量(g)。

1.3 三價鉻標準曲線的繪制 準確稱取0.500 g氯化鉻，用蒸餾水溶解并定容至100 ml容量瓶中。配成1.95 mg/ml的三價鉻溶液，分別按表1進行配置操作加樣后，定容至25 ml。充分混勻后以管1為空白對照，600 nm波長下測各管的吸光度，繪制吸光度—三價鉻含量曲線。

表1 鉻標準溶液的配制 ml

從圖1中可得,Cr(Ⅲ)的質量與吸光度值之間的線性關系為：y=0.011x-0.001，其中相關系數R2=0.999，符合要求。表明Cr(Ⅲ)在設定的濃度范圍內與吸光值呈良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于對Cr(Ⅲ)的定量測定。

圖1 三價鉻標準曲線

1.4 黑木耳多糖與三價鉻螯合條件的單因素試驗 設定pH為3，溫度25 ℃，轉速150 r/min，固定其他條件，分別考察多糖與三價鉻的質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、螯合時間(1、2、3、4、5、6 h)、三價鉻初始濃度(1、2、3、4、5、6、7 mg/ml)對其螯合率的影響。

1.5 響應面法優化螯合工藝 根據單因素試驗結果，以質量比、螯合時間、初始濃度3個因素為自變量，螯合率為響應值，進行3因素3水平響應面試驗，使用MINITABL16軟件，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，對黑木耳多糖與三價鉻的最佳螯合工藝進行優化。試驗因素與水平設計見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 螯合時間對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度為5 mg/ml，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比為5∶1，常溫下分別在1、2、3、4、5、6 h反應后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合時間。

表2 響應面分析因素水平編碼

由圖2可知，螯合時間在1～5 h范圍內，隨著時間的增加，螯合反應就越加充分，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的螯合作用也越徹底，螯合率逐漸增加。在時間達到5 h時得到最大值，螯合率為32.3%。故此單因素的最優螯合時間為5 h。

圖2 螯合時間對螯合率的影響

2.1.2 Cr(Ⅲ)濃度對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度分別為1、2、3、4、5、6、7 g/L，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比為5∶1，常溫下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合比例。

由圖3可知，隨著Cr(Ⅲ)濃度的增加，螯合率上升，當濃度為6 mg/ml時，螯合率達到最大，為38.45%。由此得出，Cr(Ⅲ)初始濃度為6 mg/ml時為最佳濃度。

圖3 Cr(Ⅲ)濃度對螯合率的影響

2.1.3 黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比對螯合率的影響。在150 r/min的條件下，Cr(Ⅲ)初始濃度為5 mg/ml，pH為3，黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，常溫下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液進行Cr(Ⅲ)含量的測定，計算螯合率，以此確定最佳螯合比值。

由圖4可知，在黑木耳多糖與三價鉻的質量比為2∶1范圍內時，隨著比值的增加，螯合率有所上升，在質量比為2∶1時螯合率達到最大值，為35.50%。此后，隨著黑木耳多糖質量的增加，螯合率降低。由此得出，質量比為2∶1時為最佳。

圖4 黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比對螯合率的影響

2.2 響應面法優化螯合條件結果 利用Box-Behnken試驗設計，確定3因素3水平，共15個試驗，見表3。其中12個析因點，3個零點。中心點重復試驗用來估計試驗誤差， 以螯合物的螯合率為響應值做響應面試驗，結果如表3所示。

表3 響應面分析方案及試驗結果

將試驗結果使用Design-Expert 7.0數理統計軟件進行回歸擬合，可得到響應值Y和各個因子(X1，X2，X3)之間的二次多元回歸方程模型為：Y=2.061 3X1+2.931 2X2-0.140 0X3+1.110 00X1X2+1.027 50X1X3-0.407 500X2X3-8.833 33X12-1.218 33X22-6.160 83X32-254.809。

對表4回歸分析數據進行方差分析可得：F回歸=294.90,P回歸=0.000;F線性=177.61,P線性=0.000;F平方=690.15,P平方=0.000;F交互=16.95,P交互=0.005;F失擬=3.57,P失擬=0.227。由此可知，黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的螯合率回歸方程的失擬項P值大于0.05，且響應面模型的相關系數R2為0.998 1，說明模型的擬合度很好。因此，可用此回歸模型代替真實的試驗點進行分析，預測該螯合物的螯合率。由F檢驗值可以得出3個影響因素對螯合物螯合率的影響程度大小依次為：螯合時間>質量比>Cr(Ⅲ)初始濃度。關于3個影響因素的相互作用，由方差分析可知，RSM模型的一次項X1(P=0.000 0)、X2(P=0.000 0)和二次項X12(P=0.000 0)、X22(P=0.000 0)、X32(P=0.000 0)以及交互項X1X2(P=0.004)、X1X3(P=0.005)系數達到了極顯著的水平，交互項X1X3(P=0.032 1)的系數顯著，而X1X2(P=0.123)，X3(P=0.409)項系數不顯著。

表4 響應面分析優化后模型的系數檢驗

注：R2=0.998 1。

根據回歸分析做出各影響因素之間相互作用的響應面圖(圖5～7)，以確認黑木耳多糖與Cr(Ⅲ)的質量比(X1)、螯合時間(X2)和Cr(Ⅲ)的初始濃度(X3)3個因素對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合率(Y)的影響。可知，黑木耳多糖與三價鉻的質量比與螯合時間對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合效果影響最大，Cr(Ⅲ)的初始濃度對螯合效果影響較小。依據回歸模型的數學分析并綜合響應圖確定螯合的最佳工藝參數為：木耳多糖與三價鉻的質量比為2.2∶1，螯合時間6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml。

圖5 質量比和Cr(Ⅲ)初始濃度交互作用對螯合率影響的等高線與響應面

圖6 時間和Cr(Ⅲ)初始濃度交互作用對螯合率影響的等高線與響應面

圖7 時間和質量比交互作用對螯合率影響的等高線與響應面

2.3 驗證試驗 回歸模型預測的得率理論值為41.61%。為了驗證模型的可靠性，采用上述優化條件進行黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成。在此條件下試驗重復3次，3次平行試驗的螯合率分別為41.33%、41.77%和41.59%，平均為41.56%，與理論預測值相比相對誤差為0.01%，預測值與實際值接近。因此，通過響應面優化法得到的黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成工藝可以用來指導實際生產。

3 結論

根據單因素試驗結果，采用響應面法對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成反應條件進行優化，以分光光度法測定黑木耳多糖與三價鉻螯合的螯合率作為評價指標，對各因素水平進行分析，得出黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物合成的優化條件為：黑木耳多糖與三價鉻的質量比為2.2∶1，螯合時間為6.18 h，三價鉻的初始濃度為5.96 mg/ml，在該條件下螯合率為41.56%。工藝驗證試驗表明，最優工藝條件可靠。目前國內外對黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合物的研究尚沒有明確的報道，因此該研究對于黑木耳多糖拓寬應用領域，及在食品、醫藥、保健品等方面的應用提供了一定的理論依據和數據支撐。

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Study on the Optimization of ChelatingAuriculariaauricularPolysaccharides and Chromium(Ⅲ) by Response Surface Methodology

YIN Hong-li, WANG Zhen-yu et al

(Department of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Department of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150090)

[Objective] Optimization ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) chelate technology. [Method] The effects of three independent variables (the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ), chelating time and chromium(Ⅲ) concentration of initial) with spectrophotometric method. And the chelation process were further optimized by response surface methodology (RSM) based on a Box-Behnken design. [Result] The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) is 2.2∶1, chelating time is 6.18 h. Chromium(Ⅲ) concentration of initial is 5.96 mg/ml. Under the optimized conditions, chelating rate is 41.56%. [Conclusion] It is feasible to optimize the chelation processing ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ). Given that, it could provide several references for further research on detection of it.

Auriculariaauricularpolysaccharides; Chromium(Ⅲ); Chelating; Response surface methodology

尹紅力(1990- )，女，山東陵縣人，碩士研究生，研究方向：功能性食品的研究與開發。*通訊作者，教授，博士，從事天然產物分離、功能性食品及生物活性材料研究。

2014-04-28

S 646.6

A

0517-6611(2014)15-04830-04