固定化Gibberella intermedia轉化3-氰基吡啶制備煙酸

楊濤，李恒，龔勁松，熊雷，朱小燕，許正宏，史勁松

（江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122）

煙酸屬于維生素B系列化合物，是人體不可缺少的營養物質，是醫藥原料和食品添加劑，目前全球市場對煙酸的需求量預計在5.5萬～6萬噸。煙酸的生產主要采用化學合成法，如氨氧化法、高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、臭氧氧化法等[1]。化學法生產煙酸時，反應條件苛刻，需要高溫高壓，過程能耗較大，并且會產生大量的廢氣廢渣等。因此，人們希望能夠采用生物技術來進行綠色制造。生物催化法生產煙酸條件溫和，反應過程易于控制，對環境的影響小，相比于化學合成法具有明顯優勢。

腈水解酶在生物合成羧酸方面具有較大的應用潛力，目前已有多種腈類化合物可以通過腈水解酶催化合成相應的有機酸[2-3]。到目前為止，盡管已有大量的不同菌屬來源的微生物被報道具有腈水解酶活性，包括Pseudomonas putida[4]，Bacillus subtilis[5]，Aspergillus niger[6]等，然而多數研究主要集中圍繞細菌腈水解酶展開。真菌腈水解酶相比于細菌腈水解酶具有諸多優勢，如良好的選擇性和溫度穩定性等，但目前已開展的真菌腈水解酶相關研究工作仍然非常有限[7]。

作者實驗室前期成功篩選獲得了一株含有極高腈水解酶活性的真菌Gibberella intermediaCA3-1[8]，該菌株在3-氰基吡啶生物轉化合成煙酸的反應中表現出較大的應用潛力。

腈類化合物在純酶催化下能更高效地進行生物轉化反應[9]，但酶分離純化及催化過程中腈水解酶易失活[10]。相比來說，全細胞轉化則具有更好的穩定性，并且轉化成本低[11]。而固定化全細胞則能進一步提高生物催化劑的應用價值和使用效率，與游離細胞相比，固定化細胞有利于產物的分離提取，可增加細胞的重復利用批次[12-13]，并能提高細胞對底物和產物的耐受性，降低生產成本[14]。

包埋法是最為常用的固定化方法[15]，已有多種材料用于腈水解酶產生菌的固定化，包括海藻酸 鈉[16]、瓊脂[17]、卡拉膠[9]、聚丙烯酰胺[11]。G. intermedia是絲狀真菌，是否可以采用上述材料進行包埋用于腈類化合物的生物轉化，目前國內外尚沒有相關文獻報道。作者利用復合材料固定化方法克服單一材料固定化細胞保留活力低、機械強度差等問題，增強固定化細胞的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

G. intermediaCA3-1，由作者實驗室篩選獲得，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4903。

1.1.2 主要試劑和設備

試劑材料：3-氰基吡啶、煙酸（純度≥98%），Sigma公司；海藻酸鈉、殼聚糖、聚乙烯醇、氯化鈣、硼酸、三聚磷酸鈉、己內酰胺等主要試劑均為國產分析純試劑；酵母粉和葡萄糖為生化等級試劑。

主要設備：DHZ-DA型恒溫搖床，太倉市實驗設備廠；電子天平，美國SARTORIUS；高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Multitron培養振蕩器，瑞士INFORS HT；立式冷凍高速離心機，日本日立公司。

1.1.3 培養基

種子培養基（g/L）：硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01，蔗糖30。

發酵培養基（g/L）：磷酸二氫鉀2.72，硫酸亞鐵0.014，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化鈉1.16，己內酰胺3.39，充分溶解后調pH值為7.0。

上述培養基均在121℃、20min進行滅菌處理。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養與菌懸液制備

G. intermediaCA3-1培養：將CA3-1菌種由斜面接入種子培養基，在30℃、200r/min的搖床上振蕩培養36h，得到種子液。按1%的接種量取種子液，接種至新鮮的發酵培養基中，在30℃、200r/min的搖床上振蕩培養60h。

菌懸液制備：將上述發酵液于8000r/min、4℃下離心6min獲得菌絲體，用生理鹽水洗滌2次后，加入適量生理鹽水制備16g/L的菌懸液。

1.2.2 固定化細胞的制備

海藻酸鈉-殼聚糖固定化：稱取一定量的海藻酸鈉在50℃水浴中攪拌溶解，同時稱取一定量殼聚糖用2%乙酸溶解。準確將16g/L的菌懸液與等體積的海藻酸鈉溶液混合均勻，用蠕動泵緩慢的將上述混合液滴入到4℃，0.6% CaCl2溶液中成球固化；固化結束后，將固定化細胞置于一定濃度的殼聚糖溶液中覆膜10min。經PBS緩沖液（pH值7.0）洗滌3次置于4℃備用。

海藻酸鈉-明膠固定化：準確將16g/L的菌懸液與等體積含有適量海藻酸鈉和明膠的固化材料溶液混合，不斷攪拌混合均勻，通過蠕動泵恒定速度滴入到4℃，0.6% CaCl2溶液中成球固化。固化結束，以PBS緩沖液（pH=7.0）洗滌3次后置于4℃備用。

殼聚糖-聚乙烯醇固定化：準確將16g/L的菌懸液與等體積含有適量殼聚糖和聚乙烯醇的固化材料溶液混合均勻。利用蠕動泵以恒定速度將以上混合液滴入到4℃，含有8%三聚磷酸鈉的飽和硼酸溶液中成球固化。制備結束，用PBS緩沖液（pH值7.0）洗滌3次后置于4℃備用。

1.2.3 固定化細胞機械強度的測定

從固定化細胞中挑選100顆大小均勻的固定化顆粒，連同30顆玻璃珠置于150mL三角瓶中，加水20mL，在220r/min、30℃旋轉式搖床處理48h。觀察未破碎的固定化細胞數（n）。

機械強度=n/100×100%

1.2.4 pH值對游離細胞和固定化細胞的影響

取等量的固定化細胞和游離細胞，在30℃， pH值分別為3、5、6、7、8、9、11條件下反應一定時間后，分別取樣測定酶活。以最適pH值下的酶活為100%計算其他pH值下樣品的相對活力。

1.2.5 溫度對游離細胞和固定化細胞的影響

取等量的固定化細胞和游離細胞，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，最適pH值下保溫一定時間，分別取樣測定酶活。以最適溫度下的酶活為100%計算其他溫度下樣品的相對活力。

1.2.6 游離細胞和固定化細胞溫度穩定性實驗

取一定量固定化細胞分別于30℃、40℃、50℃水浴保溫，定期取樣測定固定化細胞的酶活力，考察溫浴過程酶活的變化情況。

1.2.7 酶活力的定義及測定

一個單位酶活（U）的定義：在一定條件下，每分鐘催化氰基水解產生1μmol/L羧酸的酶量。

酶活力測定：取適量固定化細胞置于10mL用PBS緩沖液配置的100mmol/L 3-氰基吡啶溶液中，在30℃搖床上反應20min。反應結束，過濾收集轉化液。

轉化液離心取上清液，稀釋后利用高效液相色譜（Agilent）在268nm下檢測，色譜柱為C18柱（Waters，4.6mm×150mm，5μm），流動相為乙腈∶磷酸（0.025%）=3∶2，流速為1mL/min，柱溫30℃。每組實驗做3個平行測定。

2 結果與討論

2.1 細胞的固定化

2.1.1 固定化細胞復合材料比例選擇

海藻酸鈉-殼聚糖固定化：海藻酸鈉固定化細胞后，再用殼聚糖溶液處理，可在其表面覆膜一層薄膜，能夠起到增強固定化細胞強度的作用，但也會影響固定化細胞對底物以及產物的通透性。實驗研究了不同殼聚糖的濃度對催化活力和機械強度的影響，結果見圖1。

圖1 殼聚糖濃度對固定化細胞酶活及機械強度的影響

隨著殼聚糖濃度不斷增大，固定化細胞活力逐漸降低。主要原因為殼聚糖濃度增加后，在固定化細胞表面形成的膜厚度和致密性也相應增強，增大 了物質進出固定化細胞的阻力，導致了固定化細胞催化活力的降低。殼聚糖濃度為0.4%時，對固定化細胞活力影響小，并且機械強度也提高到12%。因此0.4%為殼聚糖覆膜的適宜濃度。

海藻酸鈉-明膠固定化：海藻酸鈉和明膠可以共混，然后用于菌絲體的固定化。

這種復合材料固定的方法，可通過調節凝膠濃度改善固定化細胞的機械強度和包埋率。與單一海藻酸鈉凝膠相比，在其中加入明膠后，使得凝膠的孔徑更大，更為松散，這對底物進出固定化細胞有促進作用[18]。如圖2所示，2.5%海藻酸鈉與2%明膠固定化細胞的活力最高，較單一海藻酸鈉固定化細胞活力提高8%左右，而且機械強度也有一定程度增加。

同樣，殼聚糖與聚乙烯醇也可以進行復合固定。單獨的殼聚糖固定化凝膠網絡疏松，空隙較多，機械強度較差，而聚乙烯醇凝膠柔韌性好，機械強度高，網格致密。兩種材料復合使用，能夠起到優勢互補作用，使得固定后的細胞既具有較好的機械強度，也可保留較高酶活力。如圖3所示，隨著聚乙 烯醇濃度的增加，固定化細胞的機械強度不斷提高，當添加濃度達到2%時，就可以使機械強度得到大幅提高。

圖2 海藻酸鈉-明膠濃度對固定化細胞強度和酶活的影響

圖3 殼聚糖-聚乙烯醇濃度對固定化細胞活力和強度的影響

2.1.2 固定化細胞制備材料的選擇

選取3種復合材料的優化配比進行固定化菌體，進行底物3-氰基吡啶轉化實驗，比較固定化細胞的相對活力和機械強度。

如表1所示，3種復合材料制備的固定化細胞均為球形。海藻酸鈉-殼聚糖復合凝膠和聚乙烯醇-殼聚糖復合凝膠的機械強度高于海藻酸鈉-明膠復合凝膠；聚乙烯醇-殼聚糖固定化后的相對酶活力達到85%，海藻酸鈉-明膠次之，海藻酸鈉-殼聚糖的活力僅為76%。此外，對于絲狀真菌而言，制球的工藝操作難度也是一項重要的衡量指標，聚乙烯醇-殼聚糖復合凝膠制備最為簡易，其次是海藻酸鈉-明膠復合凝膠，海藻酸鈉-殼聚糖凝膠制備過程復雜，難度最大。海藻酸鈉凝膠對磷酸鹽的耐受性差，并且在中性條件下小球易裂解，不易長期保存[19]；相比之下，殼聚糖-聚乙烯醇復合凝膠具有較好的磷酸鹽耐受性，而且底物3-氰基吡啶能夠提高聚乙烯 醇的穩定性，因此，從應用角度來看，殼聚糖-聚乙烯醇是固定化G. intermedia的理想載體。

表1 不同復合材料固定化的比較

2.2 pH值對固定化細胞和游離細胞活力的影響

對殼聚糖-聚乙烯醇復合固定化細胞的轉化pH值進行研究，由圖4可知，盡管固定化細胞最適反應pH值仍為7，但固定化后對酸堿的耐受性顯著 增加。

2.3 固定化細胞最適轉化溫度

考察復合固定細胞和游離細胞的最適轉化溫度，測定結果如圖5所示。

固定化細胞最適反應溫度為45℃，比游離細胞提高5℃，并且固定化細胞在30～50℃范圍內酶活均達到80%以上，固定后能提高菌體對環境溫度的適應性[11]。

2.4 固定化細胞半衰期

研究固定化菌體在不同溫度下的半衰期，考察其溫度穩定性。圖6顯示的是固定化細胞在30℃、40℃、50℃下隨時間變化的殘留酶活力。通過計算，在上述溫度下相應的半衰期分別為330.5h、128.3h、11.2h，比游離細胞分別提高了1.43倍、1.76倍和1.75倍[8]。這表明固定化能在一定程度上對細胞起到良好的保護作用，熱穩定性顯著提升，這也是固定化細胞可以重復多批次利用的前提。

圖4 pH值對固定化細胞和游離細胞酶活的影響

圖5 溫度對固定化細胞和游離細胞活力影響

圖6 聚乙烯醇-殼聚糖固定化細胞的溫度穩定性

2.5 固定化細胞底物濃度選擇

底物濃度是影響固定化細胞酶活力和轉化率的重要因素[21]，其中，高濃度3-氰基吡啶對細胞的毒性作用也得到了文獻證實，以Nocardia globerulaNHB-2腈水解酶為例，當濃度超過300mmol/L時，即表現出明顯的底物抑制[22]。采用50～700mmol/L的不同初始底物濃度來考察其對固定化細胞和游離細胞活力的影響，結果如圖7所示，當3-氰基吡啶的濃度低于100mmol/L時，相比固定化細胞，G. intermedia游離細胞具有更高酶活力，表明固定化細胞在轉化過程中受到了傳質阻力的影響；不過，當底物濃度高于100mmol/L時，游離細胞受到底物抑制作用導致轉化率不斷降低。對于固定化細胞而言，底物濃度在50～300mmol/L下，其煙酸產率不斷提高；底物濃度高于300mmol/L后，煙酸產率開始降低。該過程說明，固定化材料對細胞起到了保護作用，使其對高濃度底物的耐受性顯著提高。隨著底物濃度增加，這種優勢能得到進一步體現，傳質阻力的影響則相應弱化。

當初始底物濃度達到300mmol/L時，固定化細胞能在60min內完全轉化，而游離細胞需要100min，見圖8。由此可見，固定化細胞相比游離細胞底物 耐受性明顯提高，并能轉化高濃度的底物。

圖7 不同濃度底物對固定化細胞和游離細胞酶活力影響

圖8 不同濃度底物轉化過程曲線

2.6 固定化細胞重復批次實驗

利用固定化細胞和游離細胞進行批次轉化，研究固定化細胞和游離細胞的操作穩定性。轉化過程在最適條件下進行，底物濃度為300mmol/L。每一批次反應結束后，催化劑經過洗滌后轉入新的轉化體系中進行下一批次轉化。如圖9所示，游離細胞可重復利用9次，每克干細胞能轉化生產93.9g煙酸；固定化細胞則能重復利用26次，每克干細胞可生產283.5g煙酸。固定化細胞的轉化能力是游離細胞的3倍，其細胞利用率顯著增加。

2.7 固定化細胞的補料分批轉化

對固定化細胞分批補料連續轉化模式進行研究，以考察其對于連續轉化操作的適應性。實驗過程中，每隔1h向反應體系中添加300mmol/L 3-氰基吡啶并且取樣檢測轉化情況，見圖10。

分批補料12次，固定化細胞均能將底物完全轉化，其轉化能力相當于每克干細胞產生132.6g煙酸。當超過12次后，由于底物抑制作用轉化能力開始下降，反應體系中底物3-氰基吡啶出現積累。當補料至第19次時，固定化細胞相對酶活只有約30%，轉化能力大幅度下降。以19批次進行計算，則每克 干細胞的轉化能力達到191.3g煙酸。

圖9 固定化細胞和游離細胞的重復利用性能

圖10 固定化細胞補料分批轉化

3 結 論

利用復合固定化技術對G. intermediaCA3-1游離細胞進行固定化和轉化條件研究，以固定化細胞的相對酶活和機械強度作為綜合考察因素，選擇出聚乙烯醇-殼聚糖為理想的復合包埋材料。采用這種方式的固定化細胞，其熱穩定性和操作穩定性均比游離細胞有明顯改善，并對高濃度底物的耐受性顯著增強，單位細胞的轉化能力大幅提高。菌體固定化后，其利用效率得到改善，可用于連續循環轉化，提高了生產強度，便于產品的后續分離，使生物法制備煙酸更為經濟。

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