新輔助化療對(duì)改變非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境的臨床意義

蔡 云 羅慶豐 高 玟 詹勤元 郭善嫻

新輔助化療對(duì)改變非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境的臨床意義

蔡 云 羅慶豐 高 玟 詹勤元 郭善嫻

目的 探討新輔助化療對(duì)改變非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境的臨床意義。方法 采用MaxvisionTM免疫組化法和TUNEL方法，檢測(cè)51例非小細(xì)胞肺癌的凋亡指數(shù)和微血管密度。結(jié)果 51例非小細(xì)胞肺癌的凋亡指數(shù)平均值為10.59，與患者性別、年齡、腫瘤分型、臨床分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與接受新輔助化療治療密切相關(guān)(t值=2.11，P=0.04，P<0.05),51例非小細(xì)胞肺癌MVD值平均為33.53，其MVD值與患者性別、年齡、腫瘤分型、臨床分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與接受新輔助化療治療密切相關(guān)(t值=4.55，P=0.00，P<0.01)。結(jié)論 凋亡指數(shù)和MVD值能反應(yīng)非小細(xì)胞肺癌新輔助化療的治療效果，新輔助化療可合理用于非小細(xì)胞肺癌臨床個(gè)體化治療。

凋亡指數(shù)；微血管密度；新輔助化療； 非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1583～1585)

肺癌是人類(lèi)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，尤其是非小細(xì)胞肺癌，單一的治療方案并不令人滿(mǎn)意，5年生存率約為10%。設(shè)計(jì)綜合的個(gè)體化治療對(duì)于提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果具有重要的臨床意義，采用新輔助化療方法是近期研究的熱點(diǎn)，通過(guò)研究接受新輔助化療患者的凋亡指數(shù)和微血管密度的腫瘤微環(huán)境改變來(lái)判斷新輔助化療的療效，指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療方案制定具有重要的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料與方法

收集江西省腫瘤醫(yī)院2009年10月至2010年12月收入住院的51例非小細(xì)胞肺癌患者，年齡32～77歲，平均年齡62.5歲，患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查診斷，其中高中分化鱗狀細(xì)胞癌3例，低分化鱗狀細(xì)胞癌18例，中分化腺癌10例，低分化腺癌20例。17例接受新輔助化療(NP方案:NVB 25 mg/m2靜脈滴注,第1、5天,DDP 30 mg/m2靜脈滴注,第1～3天 )患者為實(shí)驗(yàn)組，同期住院的34例未接受新輔助化療為對(duì)照組。

1.2 TUNEL檢測(cè)方法

①石蠟切片脫蠟至水；②0.3%H2O2的甲醇液室溫作用5 min，0.01 mol/l PBS清洗兩次，每次5 min；③20 μg/ml蛋白酶K處理，濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min，PBS清洗，④加入TUNEL反應(yīng)混合液50 μl,蓋上薄膜，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，PBS清洗，⑤ 3% BSA室溫作用20 min,PBS清洗；⑥POD轉(zhuǎn)換液50 μl,蓋上薄膜，濕盒內(nèi)37℃孵育30 min，PBS清洗；⑦DAB顯色5～10 min，自來(lái)水沖洗，；⑧蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化20 s，自來(lái)水沖洗20 min；⑨梯度脫水50%，70%，80%，90%，100%，2 min/次，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.3 MaxvisionTM免疫組化法

按照免疫組化試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。CD34抗體為工作液，由美國(guó)基因公司提供，具體步驟：① 4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③ 3%過(guò)氧化氫室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；④ 抗原修復(fù)：切片浸于pH6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤ PBS洗 5 min×2次；⑥ 加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的一抗，4 ℃冰箱12 h；⑦ 復(fù)溫，PBS洗去一抗；⑧ 加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨ PBS洗2次；⑩ DAB顯色，蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片光鏡下觀察抗原在間質(zhì)微血管中表達(dá)。

1.4 結(jié)果判斷

細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI) 的計(jì)算:顯微鏡下(400倍)選取4個(gè)凋亡細(xì)胞數(shù)高視野,分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比。

CD34陽(yáng)性為血管壁細(xì)胞核棕黃色顆粒沉著，光鏡下觀察抗原在間質(zhì)微血管中表達(dá)，在200倍顯微鏡下記數(shù)3個(gè)視野的MVD，計(jì)算平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

51例非小細(xì)胞肺癌凋亡指數(shù)平均值為10.59，與患者性別、年齡、腫瘤分型、臨床分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與治療效果密切相關(guān)(t值=2.11，P=0.04，P<0.05)。51例非小細(xì)胞肺癌的MVD平均值為33.53，其MVD值與患者性別、年齡、腫瘤分型、分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與治療效果密切相關(guān)(t值=4.55，P=0.00，P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌凋亡指數(shù)及MVD值與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤特別非小細(xì)胞肺癌存在轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差，確診時(shí)大多為中晚期，單純手術(shù)治療效果并不令人滿(mǎn)意。目前大量的研究證明應(yīng)用新輔助化療的綜合治療方案，能使患者得到良好的治療效果。通過(guò)對(duì)接受新輔助化療患者的局部微循環(huán)狀態(tài)研究，探索新輔助化療在非小細(xì)胞肺癌治療中的價(jià)值。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用，是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程[1]。孫明等[2]研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡與P53基因控制有關(guān)。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，射線(xiàn)、化療藥物能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡[3]，特別是增殖能力較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)研究接受新輔助化療患者的腫瘤細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，能夠很好的反應(yīng)治療效果，研究發(fā)現(xiàn)接受新輔助化療患者的凋亡指數(shù)明顯低于未接受新輔助化療患者，其結(jié)果具有非常顯著性差異，該結(jié)果在和祝淮陽(yáng)等[4]臨床研究結(jié)果一致。

血管生成是腫瘤侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必備條件之一，新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞的增殖提供養(yǎng)分，而且是腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步侵襲的重要途徑[5]。新生血管數(shù)量(MVD值)作為反應(yīng)腫瘤血供的客觀指標(biāo)，早期腫瘤生長(zhǎng)緩慢,主要靠周?chē)M織的彌散作用提供營(yíng)養(yǎng),隨著毛細(xì)血管的生成,使腫瘤能夠獲得足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而迅速生長(zhǎng),并通過(guò)血管浸潤(rùn)周?chē)K器發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,MVD值的增高與腫瘤營(yíng)養(yǎng)供給豐富，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,所以腫瘤的MVD與它的生物學(xué)行為息息相關(guān)，本研究結(jié)果顯示MVD值與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，只顯示兩組有差別，可能與所選樣本中無(wú)轉(zhuǎn)移樣本過(guò)少有關(guān)，需加大樣本進(jìn)一步研究。有學(xué)者研究了放化療、新輔助化療、內(nèi)分泌治療對(duì)腫瘤微血管密度的影響，初步的研究結(jié)果肯定了通過(guò)抑制腫瘤血管形成起到治療腫瘤的作用[6-8]，這為腫瘤的治療提供又一新手段。

幾乎在所有癌癥，細(xì)胞凋亡失調(diào)、細(xì)胞增殖失控及腫瘤微環(huán)境的改變?cè)谀[瘤發(fā)生的過(guò)程中起了主要作用。因此用免疫組化法檢測(cè)間質(zhì)新生血管數(shù)量和檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)，綜合判斷新輔助化療在非小細(xì)胞肺癌綜合治療中的意義，為非小細(xì)胞肺癌的防治開(kāi)辟一個(gè)新的途徑，特別是為非小細(xì)胞肺癌術(shù)后的設(shè)計(jì)個(gè)體化綜合治療提供依據(jù)，有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Significance of Neoadjuvant Chemotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Microenvironment

CAIYun,LUOQingfeng,GAOWen,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To discuss the clinical significance of neoadjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer microenvironment.Methods MaxvisionTMimmunohistochemistry and TUNEL were used to detect the apoptosis index and microvessel density (MVD)in 51 cases of non-small cell lung cancer.Results Mean apoptosis index of 51 cases of non-small cell lung cancer was 10.59,apoptosis index had no relation with gender,age,tumor type,clinical stage and lymph node metastasis,and it was closely related with neoadjuvant chemotherapy(t=2.11，P=0.04，P<0.05).Mean MVD of 51 cases of non-small cell lung cancer cases was 33.53,MVD had no relation with gender,age,tumor type,clinical stage and lymph node metastasis,and it was closely related with neoadjuvant chemotherapy (t=4.55，P=0.00，P<0.01).Conclusion Apoptosis index and MVD can indicate the efficacy of neoadjuvant chemotherapy for non-small cell lung cancer.Neoadjuvant chemotherapy can be reasonably used in the treatment of non-small cell lung cancer.

Apoptosis index;Microvessel density (MVD);Neoadjuvant chemotherapy;Non-small cell lung cancer microenvironment

330029 江西省腫瘤醫(yī)院

羅慶豐

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.023

R734.2

A

1001-5930(2014)12-1583-03

2014-09-20

2014-10-20)