硫代磷酸化修飾的反義TGF-β1寡核苷酸抑制血管損傷后內膜增殖*

林志鴻, 謝良地, 吳可貴, 李庚山, 藺佩鴻

(福建醫科大學 1附屬第一醫院急診科， 2附屬第一醫院干部病房, 3福建省高血壓研究所，福建 福州 350005； 4武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430000)

血管損傷后血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的過度增殖及隨后的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)沉積在血管損傷后的再狹窄過程中扮演著至關重要的作用。血管損傷后，VSMCs許多特征與高血壓時的VSMCs相似，表現為明顯的生長合成表型、更快的生長速度、異常的生長接觸抑制及加速進入S期的細胞生長周期。同時對許多生長因子呈現出非特異性的高增殖傾向[1]。既往研究表明，血管損傷后轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達水平明顯升高，且TGF-β1顯著促進了血管損傷后VSMCs的異常增殖，促進了ECM的合成及在損傷血管內膜的堆積[2-3]。因此抑制損傷血管局部TGF-β1的高表達，將可能顯著抑制VSMCs的異常增殖及ECM在損傷血管內膜的堆積，從而減輕血管損傷后內膜的增殖和肥厚。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸的設計及合成

應用Wilbar-Lipman方法，尋找出大鼠TGF-β1的cDNA序列[4]，在跨過cDNA序列的起始密碼區ATG范圍內，設計包含有15個堿基、無修飾或硫代磷酸化修飾的反義TGF-β1寡核苷酸，同時設計與此反義寡核苷酸相對應的、作為對照的正義寡核苷酸(與反義寡核苷酸互補)，無修飾的寡核苷酸應用于離體的細胞培養實驗，而硫代磷酸化修飾的寡核苷酸則用于在體治療實驗。具體如下：反義 TGF-β1(AS TGF-β1): 5’-CGAGGGCGGCATGGG-3’；正義TGF-β1(S TGF-β1): 5’-GCTCCCGCCGTACCC-3’。上述所有的寡核苷酸均采用Model 394 DNA Synthesizer (Applied Biosystems)合成，應用OPC column(Applied Biosystems)純化。

2 Sprague-Dawley(SD)大鼠頸總動脈內膜球囊損傷

體重約400～500 g的雄性SD大鼠，由福建醫科大學實驗動物中心提供，氯氨酮(40 mg/kg)麻醉，無菌操作暴露右頸總動脈，分離至動脈交叉處，結扎頸外動脈遠端及其分支，同時暫時阻斷頸總動脈近心端及頸內動脈血流。在離動脈交叉處遠心端約0.5～1 cm處切開頸外動脈，插入2F的球囊導管(Baxter Healthcare)約2.0 cm，從導管注入0.08 mL生理鹽水擴張球囊，有明顯阻力感后來回拖拉3次，確定造成血管壁的損傷后退出球囊導管，在靠近動脈交叉處結扎頸外動脈，同時開放頸內及頸總動脈使血流再通后，縫合切口。

3 SD大鼠正常及損傷頸總動脈VSMCs的培養

上述大鼠血管球囊損傷術后1周無菌操作取出正常或損傷的頸總動脈約1～1.5 cm，置入含RPMI-1640基礎培養液(Gibco)的無菌培養皿中，采用組織塊翻轉干固法，將組織塊均勻貼附于30 mL的螺口培養瓶。從第3天起，用倒置相差顯微鏡(Olympus)觀察細胞生長情況，應用alpha-smooth muscle actin單克隆抗體(DAKO)進行免疫細胞熒光鑒定。用3～5代細胞進行實驗。

4 VSMCs增殖([3H]-TdR摻入率)的檢測

傳代培養的VSMCs進行反義寡核苷酸的干預實驗。將反義及正義的TGF-β1用無血清的RPMI-1640培養基稀釋后，加入處于同步化狀態的無血清的VSMCs，使干預寡核苷酸的最終濃度分別為0、0.01、0.1和1 μmol/L。在干預藥物加入時，同時加入3.7×107Bq/L[3H]-胸腺嘧啶核苷酸([3H]-thymidine，[3H]-TdR;中國原子能科學研究院)，共育24 h后，0.25%胰酶消化，在0.45 μm微孔濾膜上負壓抽濾，生理鹽水和10%三氯醋酸沖洗濾膜，室溫涼干后置入閃爍杯中，加入2,5-二苯基噁唑/1,4-雙[2-(5-苯基)噁唑基)苯(PPO/POPOP)/二甲苯閃爍液4 mL，靜置過夜后，在液體閃爍計數器(Tri-Carb 2300;PerkinElmer) 上進行放射性強度的測定。

5 RT-PCR檢測VSMCs TGF-β1 、纖維連結蛋白(fibronectin, FN) 及平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α, SM22α)、基質Gla蛋白(matrix Gla)及骨橋蛋白(osteopontin)mRNA的表達

將1×108cells/L VSMs接種于24孔板，每孔1 mL，培養24 h貼壁后，換用無血清的RPMI-1640培養基，繼續培養24 h，使細胞處于同步化狀態。加入AS TGF-β1干預24 h后，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后進行PCR擴增 (TaKaRa Biochemicals)。各引物序列根據文獻報道及應用Primer 3軟件設計合成。采用18S rRNA作為內參照，進行產物電泳條帶強度的半定量分析。引物序列及產物長度見表1。

表1 引物序列

6 Western blotting檢測VSMCs TGF-β1蛋白的表達

將4～6代VSMCs接種于6孔板貼壁后，換用無血清的RPMI-1640繼續培養24 h，細胞同步化后加入AS TGF-β1及S TGF-β1。干預24 h后提取細胞總蛋白質，煮沸變性10 min，按每孔5 μg蛋白質及20 μL樣本緩沖液，在8% SDS-PAGE上樣電泳約3 h，后轉至硝酸纖維素膜上，應用TGF-β1單克隆抗體(Santa Cruz)檢測蛋白質的表達，以α-tubulin(Sigma)作為內參照。

7 SD大鼠頸動脈球囊導管損傷及AS TGF-β1的干預治療

將雄性SD大鼠分為4組，每組4只，血管內膜球囊導管損傷方法同前及本實驗室以前發表的文章[5]。第1組為假手術組(僅進行頸動脈的暴露和分離，沒有血管球囊損傷)，第2組為手術損傷血管后僅給予生理鹽水2.5 μL/h, 第3組為手術損傷后給予硫代磷酸化修飾的S TGF-β1(90 g·kg-1·d-1)，最后1組為手術損傷后給予硫代磷酸化修飾的AS TGF-β1(90 μg·kg-1·d-1)。所有給藥途徑均采用ALZET 泵從皮下注射，連續給藥28 d，每7 d根據體重的變化調整藥物用量。術后28 d迅速取出損傷或未損傷的頸總動脈約1 cm，去除血液及周圍結締組織后置于4%甲醛中，常規脫水、石蠟包埋，切成6～10 μm的薄片，HE染色。應用圖像分析儀(CMIAS-B型多功能真彩色病理圖像分析系統，北京航空航天大學圖像中心)攝像求積法測定血管的內膜與中膜的面積比(intima/media，I/M)。

8 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間差異比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1 mRNA表達的影響

各種濃度(0.01～1 μmol/L)的AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1mRNA表達并無明顯作用，表明AS TGF-β1的作用環節并不在轉錄水平上，因為它并不影響TGF-β1mRNA的生成,見圖1。

Figure 1. Effects of AS TGF-β1 on the expression of TGF-β1 mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4.

2 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果表明，AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制損傷VSMCs TGF-β1蛋白的表達(P<0.05)，而S TGF-β1對損傷后VSMCs過度表達的TGF-β1蛋白并無抑制作用(P>0.05)。這表明AS TGF-β1的作用機制是抑制了TGF-β1mRNA的翻譯過程，從而抑制了TGF-β1蛋白在損傷VSMCs的過度表達，見圖2。

Figure 2. Effects of S TGF-β1 and AS TGF-β1 on the expression of TGF-β1 protein in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

3 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs 增殖的影響

AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制血管損傷后VSMCs DNA的合成，S TGF-β1對VSMCs [3H]-TdR的摻入率并無明顯作用；不管是反義、還是正義的TGF-β1寡核苷酸對非損傷血管的VSMCs DNA的合成均無明顯的量效作用，見圖3。

4 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs合成ECM的影響

AS TGF-β1顯著抑制了血管損傷后VSMCs FN的合成，且AS TGF-β1的抑制作用呈濃度依賴性，見圖4。表明血管損傷后VSMCs合成ECM增多，而AS TGF-β1有抑制VSMCs合成和分泌ECM的作用，從而降低血管損傷后ECM的沉積，抑制血管新生內膜的形成。

5 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs表型的作用

AS TGF-β1對代表收縮表型的SM22α mRNA的表達水平呈現明顯的促進作用；而對合成表型標志物的基質Gla蛋白和骨橋蛋白mRNA表達水平則呈現顯著的抑制作用，這兩種相反的作用均在0.01及0.1 μmol/L劑量最為明顯，見圖5。

6 AS TGF-β1及S TGF-β1對血管損傷后新生內膜形成的作用

血管損傷后，內膜明顯增厚，管腔狹小，而中膜并無顯著變化，I/M較血管未損傷組明顯增加(0.19±0.03vs1.76±0.16,P<0.01)；AS TGF-β1治療4周顯著抑制了血管損傷后新生內膜的形成，增加了管腔面積，降低了I/M，為損傷組的32%(1.76±0.16vs0.56±0.08,P<0.01)；S TGF-β1對血管損傷后新生內膜的肥厚并無顯著影響，I/M與損傷組無明顯差別(1.55±0.11vs1.76±0.16,P>0.05),見圖6。

Figure 3. Effects of S TGF-β1 and AS TGF-β1 on the DNA synthesis in VSMCs with (A)or wihtout (B) vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

Figure 4. Effects of AS TGF-β1 on the expression of FN mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

討 論

反義寡核苷酸是一種未修飾或經過化學修飾的單鏈DNA分子，一般由13～25個核苷酸組成，通過細胞內化作用，短寡核苷酸可進入細胞內，進入胞內的反義寡核苷酸與其目標mRNA特異性結合，阻斷了目的mRNA的翻譯，從而抑制該蛋白質表達，影響了細胞相應的功能[6]。這種特異性的結合，使得反義寡核苷酸技術在有選擇性地調整和改變某些與疾病病理過程有關的基因方面，變得越來越具有吸引力。

我們的研究結果也證實AS TGF-β1呈濃度依賴性抑制了血管損傷后VSMCs TGF-β1蛋白質的過度表達，但并不影響轉錄水平上TGF-β1mRNA的生成，而S TGF-β1并不影響TGF-β1蛋白質的表達。表明我們所設計的反義TGF-β1寡核苷酸能夠特異性地制VSMC TGF-β1的表達水平，而且這種作用主要表現在翻譯水平上。

已有研究發現，損傷血管內膜TGF-β1的表達明顯升高，且顯著促進了損傷血管VSMCs的異常增殖、ECM的合成及在損傷血管內膜的堆積[7]。本研究中，我們發現AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制了血管損傷后VSMCs DNA的合成，減少VSMCs合成和分泌ECM-FN，但對未損傷血管的VSMCs并無明顯作用。在血管損傷后初期對VSMCs的抑制作用，也許足于減少血管壁ECM的堆積，及至抑制血管損傷后內膜肥厚的最終形成。有研究表明在損傷后2周，TGF-β1mRNA的表達水平可達到正常的5～7倍，因此若能在損傷早期抑制TGF-β1的過度表達，則可明顯降低ECM的堆積，減輕內膜肥厚的形成[8]。

Figure 5. Effects of AS TGF-β1 on the expression of SM22α (A)， osteopontin (B) and matrix Gla (C) mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

Figure 6. Effects of S and AS TGF-β1 on the intimal formation after vascular injury in SD rats (HE staining,×80). Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs non-injury group; △△P<0.01 vs AS TGF-β1.

我們的研究結果也證實頸動脈損傷后，血管中膜并無顯著變化，但血管內膜明顯增厚，管腔變小。應用硫代磷酸化修飾的AS TGF-β1經皮下連續給藥28 d后，顯著抑制了血管損傷導致的內膜增生，管腔擴大，I/M比值下降，而S TGF-β1對血管損傷后新生內膜的增生并無明顯作用。表明了AS TGF-β1由于抑制了血管損傷后VSMCs的增殖、ECM的合成和分泌，減少了ECM在血管內膜中的沉積，從而減輕了血管損傷后內膜的肥厚。以前的研究也證實了局部給予AS TGF-β1也能顯著抑制血管損傷后內膜的增殖[9]。

研究發現血管損傷后，VSMCs的表型由收縮表型轉變為合成表型，而合成表型的VSMCs可能合成更多的生長因子、細胞因子和血管活性物質等[10]。同時VSMCs對各種生長因子和血管活性物質，包括對TGF-β1的反應性也發生了變化，使TGF-β1由原來的抑制VSMCs增殖轉而變為促進VSMCs的增殖。AS TGF-β1抑制血管損傷后VSMCs的異常增殖可能與其逆轉血管損傷后VSMCs的表型轉變有關。我們的研究發現應用AS TGF-β1后，VSMCs收縮表型標志物SM22α的mRNA表達水平明顯增加，而代表合成表型標記物的基質Gla蛋白及骨橋蛋白的mRNA的表達水平卻受到顯著抑制。因此，由于AS TGF-β1使VSMCs的表型由血管損傷后的合成型恢復為未損傷時的收縮型，減少各種促生長因子、細胞因子和血管活性物質等的分泌，從而抑制了VSMCs的增殖，減少了ECM的合成和分泌，減輕了血管損傷后再狹窄的發生和發展。

總之我們所設計的AS TGF-β1能夠特異性地抑制血管損傷后TGF-β1蛋白質的過度表達，逆轉了VSMCs在損傷后表型的轉變，從而顯著抑制了血管損傷后VSMCs DNA的合成和細胞增殖，減少了ECM的合成和分泌，減輕了血管損傷后內膜的增殖。因此，AS TGF-β1有望為抑制血管損傷后新生內膜的形成，減輕PTCA術后再狹窄提供新的治療方法和手段。

[參 考 文 獻]

[1] Rudijanto A. The role of vascular smooth muscle cells on the pathogenesis of atherosclerosis [J]. Acta Med Indones,2007,39(2):86-93.

[2] Khan R, Agrotis A, Bobik A. Understanding the role of transforming growth factor-β1in intimal thickening after vascular injury[J]. Cardiovasc Res，2007,74(2): 223-234.

[3] Yao EH, Fukuda N, Ueno T, et al. A pyle-imidazole polyamide targeting transforming growth factor-beta1 inhibits restenosis and preserves endothelialization in the injured artery[J]. Cardiovasc Res，2009,81(4):797-804.

[4] Yang Y, Mumy M, Romeo D, et al. Identification of the start sites for the 1.9- and 1.4-kb rat transforming growth factor-beta1 transcripts and their effect on translational efficiency[J]. Gene, 1998, 219(1-2): 81-89.

[5] 林志鴻，吳可貴，李庚山,等.氟伐他汀抑制球囊損傷后兔的血管內膜增殖[J].中國病理生理雜志，2005，21(1)：99-103.

[6] Inouye M. Antisense RNA: its function and application in gene regulation - a review [J]. Gene, 1988, 72(1-2): 25-34.

[7] Bobik A. Transforming growth factor-βs and vascular disorders [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(8):1712-1720.

[8] Merrilees M, Beaumout B, Scott L, et al. Effect of TGF-β1antisenseS-oligonucleotide on synthesis and accumulation of matrix proteoglycans in balloon catheter-injured of rabbit carotid arteries[J]. J Vasc Res, 2000, 37(1):50-60.

[9] Sun DX, Liu Z, Tan XD, et al. Nanoparticle-mediated local delivery of an antisense TGF-β1 construct inhibits intimal hyperplasia in autogenous vein grafts in rats[J]. PLoS One,2012, 7(7): e41857.

[10] Chaabane C, Otsuka F, Virmani R, et al. Biological responses in stented arteries[J]. Cardiovasc Res, 2013, 99(2):353-363.