失血性休克后的腸淋巴液提高血管通透性的作用*

孫改霞， 郭亞雄， 杜會博， 張立民， 趙自剛， 劉圣君， 牛春雨

(河北北方學院微循環研究所，河北 張家口 075000)

血管通透性增高是重癥休克患者出現組織水腫、引起毛細血管滲漏綜合征、進而加重組織細胞缺氧和微循環障礙的關鍵環節[1]。因此，探討重癥休克血管通透性增高的發生機制，并以此針對相關靶點探求重癥休克的干預措施，是當前防治重癥休克的重點研究課題。研究表明，失血性休克后的腸淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph, PHSML)回流是器官損傷的一個關鍵環節[2-3]；腸淋巴液在重癥休克血管高通透性中的作用值得關注。為此，本文目的在于從整體動物模型入手，觀察PHSML引流對失血性休克大鼠肝、腎、心肌、肺、脾、小腸等組織血管通透性的作用；并進一步觀察引流至體外的PHSML對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)通透性的作用，闡明PHSML與血管高通透性的關系。

材 料 和 方 法

1 動物與分組

健康、SPF級Wistar雄性大鼠18只(中國軍事醫學科學院實驗動物中心)經過適應性飼養后用于本實驗，體重 220～260 g。實驗前12 h禁食、自由飲水，隨機均分為：假手術組 (sham)、休克組 (shock)和休克+引流組 (shock+ drainage)。實驗過程中動物處置方法符合倫理學規范。

2 失血性休克模型復制與腸淋巴液引流

所有大鼠經乙醚誘導、戊巴比妥鈉 (50 mg/kg；Merck) 注射全身麻醉后，休克組和休克+引流組大鼠按我室報道的以股動脈勻速放血(10 min)、調整放血量維持平均動脈血壓[(40±2) mmHg, 90 min]的方法，建立失血性休克模型[4]，液體復蘇(回輸放出血液+等量林格氏液，30 min)后，觀察至6 h；休克+引流組大鼠在液體復蘇后即刻，按我室常規方法引流腸淋巴液至6 h[4]，按0～3 h和3～6 h時間段分為2份，離心去細胞，冷凍于-80 ℃，用于后續實驗；休克組動物僅剝離腸淋巴管；假術組動物僅行相同手術操作，但不放血、不輸液、不引流腸淋巴液，觀察至與其它各組相對應時點。

3 注射伊文氏藍與灌洗

在液體復蘇后5.5 h，經股靜脈注射1%伊文氏藍(Evans blue，EB; Sigma)溶液(30 mg/kg)，30 min后開胸，立即連有生理鹽水(37 ℃)輸液瓶的鈍性穿刺針穿刺至左心室心尖部深入主動脈，同時在右心耳底部作一切口，沖洗體循環內的EB。然后，將穿刺針插入肺動脈，并在左心耳底部作一切口，行肺循環灌洗。

4 組織留取與外觀顏色觀察

在灌流至無藍色液體流出為止，立即留取固定位置的心肌(左心室肌)、肝 (左外葉下緣)、脾、腎 (左腎正中縱行切開后縱切面)、小腸 (十二指腸下10 cm處，長約5 cm)和肺 (左肺下緣)組織，用生理鹽水洗去表面污物，用濾紙吸干表面附著水分，置于平皿中，在解剖鏡(SZ2-ILST，Olympus)下觀察外觀顏色，應用數碼照相機 (Nikon)拍照。

5 組織EB濃度檢測

首先，準確稱取1 mg EB、0.2 g牛血清白蛋白，溶于5 mL 0.9%生理鹽水中作為儲備液。采取倍比稀釋法配制不同濃度的標準液，在波長620 nm處，檢測各標準液吸光度值，繪制標準曲線方程：y=0.088x+ 0.005x2+0.000254x3，R2=0.9963。然后，取固定位置的心肌(左心室肌下緣)、肝(左外葉下半部分)、脾(下半部分)、腎(左腎正中縱行切開的一半)、小腸(十二指腸下15 cm處，長約5 cm)和肺(肺左葉)組織，約0.1～0.3 g，剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，按100 mg待測組織加入1 mL甲酰胺 (Sigma)，置于50 ℃水浴孵育24 h，3 000 r/min離心10 min，取上清分別測定620 nm、740 nm波長處的吸光度，結合文獻[5-6]，代入公式：校正A620=實際測量A620-1.426A740-0.03,計算校正吸光度值，代入方程，計算EB濃度。將組織塊沉渣放入80 ℃恒溫箱烤24 h至恒定，稱干重，作為組織EB濃度的標準化處理，即：EB濃度/組織干重(μg/g)。

6 組織干濕重比值檢測

取固定位置的心肌 (左心室肌外緣)、肝 (左外葉上半部分)、脾 (上半部分)、腎 (左腎正中縱行切開的一半)、小腸 (十二指腸下10 cm處，長約5 cm)和肺 (右肺中葉)組織，用濾紙吸干表面附著水分；應用分析天平準確測量，并記錄組織的濕重 (wet weight, W)；然后于80 ℃恒溫箱烤72 h至組織干重恒定，稱干重 (dry weight, D)，計算D/W比值。

7 HUVECs形態學觀察

將新購自上海嚴謹生物公司的HUVECs，按常規方法復蘇、傳代，制備5×108/L左右的細胞懸液，移入96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，將96孔板放置于37℃、5%CO2孵育箱(Thermo)中培養，待細胞單層融合至70%～80%時，按下述處理因素分為7組：DMEM組(DMEM培養基，Gibco)、DMEM+胎牛血清 (fatal bovine serum,FBS)組(DMEM培養基含10% FBS)、脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS; Sigma)組 (含10 mg/L LPS的DMEM培養基)、4% 休克復蘇后0～3 h腸淋巴液組(含4%休克復蘇后0～3 h腸淋巴液的DMEM培養基，簡稱4% PHMSL 0～3 h組)、10% PHMSL 0～3 h組、4% PHMSL 3～6 h組和10% PHMSL 3～6 h組。待各種因素與HUVECs作用6 h后，倒置顯微鏡(Leika)下觀察不同處理因素對HUVECs形態的影響。

8 HUVECs活性觀察

待各種處理因素與HUVECs (設6個復孔) 作用6 h后，每孔中加入10 μL MTT(Amresco，5 g/L)，繼續在培養箱中孵育4 h，然后吸棄孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO(Fisher)，置于搖床上振蕩10 min，充分溶解；使用M3型酶標儀(MD)在波長490 nm處測量各孔A值，以此反映細胞活性。

9 單層內皮細胞通透性測定

首先，將Transwell小室 (上室；Corning)放在24孔細胞培養板 (下室)上，在上室中加入DMEM培養液，37℃預孵育24 h；將濃度為2.4×107/L HUVECs懸液100 μL接種于上室，下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培養基，至37 ℃、5%CO2培養箱中孵育；24 h后，待細胞融合生長形成致密的單層細胞；按前述處理因素，更換上室中培養液；更換下室培養液為無血清DMEM培養基，作用6 h后，應用EVOM2型跨上皮電阻測量儀 (WPI)，測量跨細胞電阻 (trans-endothelial electrical resistance，TEER)。然后，吸去上室中的培養液，加入100 μL含有FITC-Albumin(1 g/L，Sigma)的DMEM培養基，避光孵育45 min，收集上、下室液體100 μL，移入96孔板(其中上室液體稀釋50倍)，采用酶標儀的熒光強度測量模塊讀取熒光強度 (激發波長：485 nm；發射波長：525 nm)，同時測量底室液體量。結合文獻[7-10]計算單層血管內皮細胞對白蛋白的通透系數(Pa)：Pa= ([A]/t) × (1/A) × (V/[L])。其中，[A]為下室熒光吸光度；t為作用時間，以秒計算；A是濾膜面積，以cm2計算；V為下室液體量，以mL計算；[L]為上室熒光吸光度。

10 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統計軟件包進行方差齊性檢驗，方差齊(P>0.10)的資料多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊(P≤0.10)的資料采用Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PHSML引流對失血性休克大鼠各組織EB滲出情況的影響

如圖1所示，休克組大鼠肺、心、腎、肝、脾和小腸組織表面的藍色較假手術組深，休克+引流組大鼠的這些組織表面的藍色較休克組淺；通過甲酰胺萃取EB、定量分析檢測表明：休克組大鼠肺、心、腎、肝、脾和小腸組織EB滲出量均顯著高于假手術組 (P<0.05)，休克+引流組大鼠肺、心、腎、肝、脾、腸組織EB滲出量均顯著低于休克組 (P<0.05)，且心和腎組織EB滲出量高于假手術組 (P<0.05)。

2 PHSML引流對失血性休克大鼠各組織干濕比值的影響

在液體復蘇結束后6 h，休克組大鼠心肌、肝、脾、腎、小腸和肺組織的D/W比顯著低于假手術組(P<0.05)；休克+引流組大鼠心肌、肝、脾、腎、小腸和肺組織的D/W比顯著高于休克組(P<0.05)，且與假手術組無統計學意義(P>0.05)，見表1。

3 PHSML腸淋巴液對HUVECs形態的影響

各種因素處理HUVECs 6 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：DMEM和DMEM+FBS組細胞生長旺盛，呈鵝卵石樣貼壁，2組細胞的形態無明顯差別(圖2A、2B)；4% 0～3 h PHSML處理后，細胞間隙增大，細胞間連接消失，胞體發生不規則收縮，部分細胞懸浮甚至脫落(圖2C)，PHSML濃度加大到10%時，細胞胞膜邊緣進一步模糊，失去完整性，細胞碎片增多，胞內顆粒密集，呈現典型拉網現象 (圖2D)；4% 3～6 h PHSML處理后，細胞間隙開始逐步拉大，胞體發生小范圍收縮，部分細胞懸浮(圖2E)，PHSML濃度加大到10%時，細胞胞體失去完整性，胞膜邊緣模糊不清，有細胞碎片，胞內顆粒增加 (圖2F)；LPS處理后，細胞失去了典型的鵝卵石樣形態，細胞收縮變形，結構發生不規則改變，較多細胞懸浮甚至脫落(圖2G)。

4 PHSML對HUVECs細胞活性的影響

DMEM組與FBS+DMEM組細胞活性無顯著差異(P>0.05)；4%和10% 0～3 h、4%和10% 3～6 h的PHSML以及LPS均降低了HUVECs的活性，與DMEM組和FBS+DMEM組均有顯著差異(P<0.05)；在4個PHSML作用組中，以10% 0～3 h PHSML降低HUVECs活性的作用最強，均顯著低于其它3組(P<0.05)；4% 3～6 h PHSML的作用顯著弱于LPS組(P<0.05)，其它3個PHSML組與LPS組無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

表1 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠各組織干濕重比值的影響

Figure 2. Effect of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the cellular morphology of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation(×200).A: DMEM group; B: FBS+DMEM group; C: 4% PHSML 0～3 h group; D: 10% PHSML 0～3 h group; E: 4% PHSML 3～6 h group; F: 10% PHSML 3～6 h group; G: LPS group.

5 PHSML對HUVECs單細胞通透性的影響

如圖4所示，各種因素與HUVECs孵育6 h后，結果顯示：DMEM組與FBS+DMEM組細胞TEER值、Pa值無顯著差異(P>0.05)；4%和10%休克復蘇后0～3 h、4%和10%休克復蘇后3～6 h PHSML以及LPS均降低了TEER，提高了Pa值，與DMEM組和FBS+DMEM組均有顯著差異(P<0.05)。在4個PHSML作用組中，以10%休克復蘇后0～3 h PHSML組HUVECs的TEER值最低，均顯著低于其它3組(P<0.05)，且低于LPS陽性對照組(P<0.05)；以4%休克復蘇后3～6 h PHSML作用的HUVECs的TEER值最高，均顯著高于其它3個淋巴液作用組與LPS組 (P<0.05)。同時，在4個PHSML作用組中，以4%休克復蘇后3～6 h PHSML組HUVECs的Pa值最低，均顯著低于其它3組 (P<0.05)；LPS作用于HUVECs后，Pa值最高，均顯著高于4個PHSML組(P<0.05)。

Figure 3. Effect of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs DMEM or FBS+DMEM group; #P<0.05 vs 4% PHSML 0～3 h group; △P<0.05 vs 4% PHSML 3～6 h group.

討 論

目前，國內外學者一般從整體動物模型、離體灌流器官或組織模型、單層內皮細胞模型等3個層次研究血管通透性[11]。在整體動物模型上，人們一般從靜脈注射EB、[125I]白蛋白或熒光標記的白蛋白，然后測定組織中EB含量、放射性強度或熒光強度，來反映組織的通透性[11]。為了全面探討、了解休克腸淋巴液回流在重癥休克引起血管通透性增高這一過程中的作用，本研究首先應用靜脈注射EB、再行全身灌洗、甲酰胺萃取的方法，觀察了PHSML引流對失血性休克大鼠肺、肝、腎、心肌、脾、小腸等組織中EB含量滲出的影響。

研究表明，PHSML引流均可降低失血性休克大鼠各組織EB含量，從灌洗的各組織器官表面的顏色變化也佐證了這一結果。研究結果提示，失血性休克引起的血管高通透性在各組織器官均有所表現，且PHSML引流的作用具有普遍性。應當指出，在這一實驗中，全身灌洗是影響實驗成敗的關鍵技術。一方面，灌洗不完全，會直接影響組織中EB的結果；另一方面，灌洗壓力過高，可能會引起肺循環壓力過高，引起肺水腫，使實驗結果出現較大偏差。為此，在本實驗中，結合相關文獻[6, 12]報道，建立了先行體循環灌洗、再行肺循環灌洗的方法，避免了由于灌洗導致的肺水腫發生；并結合灌洗過程中重要器官肝、肺表面顏色的變化判斷灌洗是否完全，同時，考慮到可能存在灌洗不足的因素，又結合相關文獻[5-6]，去除了與血紅蛋白結合的伊文氏藍引起吸光度的影響，應用校正公式進行伊文氏藍濃度的計算。國外的一些研究，也應用靜脈注射EB，行支氣管肺泡灌洗，將獲得的支氣管肺泡灌洗液與血漿EB濃度的百分比作為肺血管通透性指標，證明了失血性休克、燒傷后肺組織血管通透性增高，也發現了阻斷PHSML回流降低了肺組織的血管通透性[13-15]。但這些研究均集中在肺損傷的研究，而本文結果進一步證實了PHSML回流是導致失血性休克后各組織器官血管通透性的重要因素。

Figure 4. Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the permeability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation.A: changes of trans-endothelial electrical resistance (TEER) in HUVECs; B: changes of monolayer permeability to of HUVECs FITC-labeled albumin. Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs DMEM or FBS+DMEM group; #P<0.05 vs 4% PHSML 0～3 h group; ■P<0.05 vs 10% PHSML 0～3 h group; □P<0.05 vs 4% PHSML 3～6 h group; ▲P<0.05 vs 10% PHSML 3～6 h group.

血管通透性增加的后果，就是引起組織液生成超過回流，導致組織水腫的發生。為此，本研究進一步檢測了各組織器官的D/W值。結果顯示，失血性休克組大鼠的肺、肝、腎、心肌、脾、腸等組織的D/W值均顯著降低，出現了組織水腫；PHSML引流提高了休克大鼠各組織的D/W值，表明減輕了組織水腫的程度，這與降低過高的血管通透性有關。研究結果從另一個側面，進一步驗證了PHSML引流降低血管高通透性的作用。

血管內皮細胞的完整性以及它們之間的連接是維持血管內皮屏障以及血管內皮細胞通透性的重要結構學基礎[16]。生理條件下，血管通透性的調節涉及跨細胞途徑和細胞旁途徑[16]。跨細胞途徑，即穿過內皮細胞到達周圍組織[17]；一般情況下，蛋白質及脂質主要是通過該途徑來實現血管內外的物質交換與平衡[18]。細胞旁途徑，是指一些物質從內皮細胞間隙穿過血管到達周圍組織[19]。跨細胞途徑功能的實現與內皮細胞的骨架蛋白形成的網狀結構的完整性有關，細胞旁路途徑功能的實現主要依靠細胞間黏附或連接分子的表達有關[19]。為了進一步探討PHSML對血管通透性的作用，觀察了將引流至體外的PHSML對HUVECs通透性的影響，并以LPS作為陽性對照。

形態學觀察結果顯示，不同濃度、不同時間的PHSML作用于HUVECs 6 h后，均引起了HUVECs結構學損傷，破壞了完整性，從血管內皮細胞通透性的跨細胞途徑這一方面解釋PHSML引起血管通透性增高的細胞機制；同時，細胞間隙增大、細胞間連接消失，表明PHSML可能引起了HUVECs間的連接狀態，這可能從血管內皮細胞通透性的細胞旁途徑這一方面解釋休克腸淋巴液引起血管通透性增高的細胞機制。可見，PHSML增加HUVECs通透性的作用可能與2種途徑均有一定關系。

為了進一步明確PHSML對HUVECs結構與完整性的損傷作用，本文應用MTT法檢測了PHSML對HUVECs生長活性的影響。結果顯示，不同濃度、不同時間的PHSML作用6 h均降低了HUVECs生長活力，使HUVECs存活數減少；這些結果與形態學觀察結果是一致的，從另一個角度證明了PHSML對HUVECs的損傷作用。結果也說明PHSML增加內皮細胞通透性的作用是通過破壞血管內皮屏障的跨細胞途徑實現的，而PHSML對與跨細胞途徑功能密切相關的骨架蛋白的表達，還有待進一步觀察。

TEER檢測與單層細胞對白蛋白的通透系數已廣泛應用于細胞通透性的檢測；一般來說，單層細胞的TEER值越大，說明單層細胞越致密，通透性越小，單層細胞對白蛋白的通透系數越大，表明單層細胞通透性越高。本實驗關于TEER與單層細胞對白蛋白的通透系數檢測結果表明，不同濃度、不同時間的PHSML降低了HUVECs的TEER，提高了Pa值，說明PHSML增加內皮細胞通透性的作用與破壞細胞間的致密結構是相關的，也說明PHSML的作用是通過破壞細胞間黏附或連接分子實現的。當然，PHSML對HUVECs黏附連接或緊密連接蛋白的作用還有待進一步研究。

在上述研究中也發現，10%的失血性休克液體復蘇的0～3 h腸淋巴液的損傷作用最強，細胞活性接近LPS的作用，降低TEER的作用則明顯強于LPS對照組，這也與我們前期觀察到腸淋巴液中有高濃度內毒素的結果是一致的。這也表明，在失血性休克液體復蘇的0～3 h內，腸淋巴液的毒性作用最強，提示應關注在這一時段腸淋巴液的病理學作用。

總之，減少PHSML回流，有利于降低休克引起各組織器官過高的血管通透性；PHSML引起了HUVECs的形態學損傷、降低了生長活性、降低了TEER、提高了對FITC標記白蛋白的通透系數，提示PHSML回流提高血管通透性的機制與破壞內皮細胞的通透性有關，其機制涉及細胞通透性的跨細胞途徑與細胞旁途徑，相關機制還需進一步研究。

[參 考 文 獻]

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