miR-155特異性siRNA增強阿糖胞苷誘導的Burkitt淋巴瘤Raji細胞凋亡*

劉平平， 朱錦燦， 鄭 力， 劉善淘， 譚廣銷， 何冬梅， 劉革修△

(1清華大學第一附屬醫院血液腫瘤科，北京 100016； 2暨南大學醫學院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

Burkitt淋巴瘤是一種罕見而又高度惡性的非霍奇金淋巴瘤，約占成人非何杰金淋巴瘤的1%～5%。雖然利妥昔單克隆抗體使Burkitt淋巴瘤患者的總生存率有了明顯提高，但是化療依然是本病主要的治療方案。然而化療仍然存在多種不良反應，如高強度阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)可導致骨髓抑制、高尿酸血癥、骨骼和肌肉疼痛、咽痛、發熱、全身不適等。所以，進一步研究提高療效方案，增強其對化療藥物敏感性，對治療具有重要意義。最近研究[1-6]發現miR-155在腫瘤中高表達可能直接或間接地抑制腫瘤細胞凋亡，如其在小兒Burkitt淋巴瘤、彌漫大B細胞性淋巴瘤、原發縱隔B細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的表達水平遠遠高于正常循環中B細胞，而且表達水平高者預后較差。本研究將通過觀察miR-155特異性siRNA對Ara-C誘導Burkitt淋巴瘤Raji細胞凋亡的影響，為Burkitt 淋巴瘤的臨床治療研究提供基礎依據。

材 料 和 方 法

1 材料

LipofectamineTM2000購于Invitrogen；miR-155 siRNA由上海吉瑪公司設計及合成；miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒和miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒購于天根生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購于同仁化學研究所; 阿糖胞苷購于蘇州市尤利特生物醫藥科技有限公司；annexin V/PI雙染試劑盒購于碧云天生物技術研究所；RPMI-1640培養基和胎牛血清購于HyClone;Burkitt淋巴瘤Raji細胞株由本實驗室保存。

2 方法

2.1細胞培養 將Raji細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基中置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中培養。

2.2CCK-8法檢測細胞增殖活性 實驗分為正常對照組、溶媒對照組、Ara-C組(濃度分別為：2.5、5、10、20 mg/L)、siRNA組(濃度分別為：0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μmol/L)和Ara-C+siRNA組，根據LipofectamineTM2000操作說明進行siRNA轉染。取對數生長期細胞以2×107/L密度接種于96孔板中, 每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中培養。培養48 h后采用CCK-8法檢測，并通過以下公式計算增殖抑制率：增殖抑制率(%)=[1-(實驗組A450-正常組A450)/正常組A450]×100%，實驗重復3次。

2.3qRT-PCR檢測miR-155的表達 取對數生長期細胞以5×107/L密度接種于6孔板中, 每孔2 000 μL，以1.0 μmol/L siRNA轉染干預， 24 h后，收集細胞，加入miRcute miRNA提取分離試劑盒提取miRNA，經純度及電泳檢測后，根據miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作說明，反轉錄合成cDNA第1鏈，采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-155的表達，以U6 snRNA為內參照，采用2-ΔΔCt法進行miR-155相對表達量的計算。其中，U6 snRNA上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-155上游引物5’-GCGGTTAATGCTAATCGTGAT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.4細胞凋亡的檢測 Annexin V-PI 雙染觀察經不同處理后的Raji細胞凋亡率。取轉染48 h后各組Raji細胞， 加入195 μL annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL annexin V-FITC輕輕打勻，室溫避光孵育10 min，離心棄上清，190 μL annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10 μL PI染色液，冰浴避光，行流式細胞術檢測。

2.5Western blotting印跡法檢測 Ara-C(5 mg/L)單獨或聯合miR-155 siRNA處理Raji細胞48 h，收集并PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經10% SDS-PAGE電泳分離后，常規轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h。鼠抗人caspase-3和GAPDH抗體4 ℃過夜，1∶2 000稀釋的HRP標記Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用SNK-q或Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 轉染后miR-155表達水平

轉染后24 h，提取總RNA，qRT-PCR檢測各組細胞miR-155的表達水平，見圖 1。其中miR-155 siRNA組(siRNA group)分別與未轉染組(normal group)及無義轉染組(scrambled control group)相比，miR-155表達量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，未轉染組與無義序列轉染組比較，差異無統計學意義(P>0. 05)。

Figure 1. The relative expression of miR-155 in Raji cells after transfection with miR-155 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal group.

2 miR-155 siRNA與Ara-c單獨及聯合作用對Raji細胞增殖的抑制作用

CCK-8結果顯示，miR-155 siRNA單獨處理Raji細胞顯現出一定程度的增殖抑制作用，不同濃度的Ara-C均顯示出增殖抑制性，并呈量效關系，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；同時，miR-155 siRNA與Ara-C聯合作用于Raji細胞后，增殖抑制率明顯高于相應Ara-C,差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。這表明轉染miR-155 siRNA入Raji細胞后可使Ara-C抑制增殖的作用明顯增強。

Figure 2. Ara-C alone or in combination with miR-155 siRNA inhibited the proliferation of Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

3 Annexin V-PI 雙標記檢測Raji細胞凋亡

流式細胞術結果顯示siRNA+Ara-C組凋亡率為 (38.4±1.4)%；Ara-C組、siRNA組凋亡率分別為 (16.5±0.3)%和 (14.6±0.3)%。siRNA+Ara-C組與Ara-C組、siRNA組及對照組[(3.6±0.4)%]相比都有顯著差異(P<0.05)，見圖3。這表明miR-155 siRNA與Ara-C聯合作用比單用miR-155 siRNA或Ara-C顯示出更強的誘導Raji細胞凋亡的作用。

Figure 3. The effects of Ara-C alone or combined with miR-155 siRNA on the apoptosis of Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

4 miR-155 siRNA聯合阿糖胞苷對Raji細胞caspase-3蛋白表達的影響

與Ara-C(5 mg/L)單獨使用相比，Ara-C(5 mg/L)與miR-155 siRNA聯合作用于Raji細胞，其caspase-3蛋白的表達顯著增加，見圖4。

Figure 4. The effects of Ara-C or combined with miR-155 siRNA on the protein expression of caspase-3 in Raji cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs Ara-C group.

討 論

miRNA以不完全互補的方式與靶基因mRNA的3’UTR結合，調控多個靶基因，或多個miRNA共同調節一些特殊的靶基因[7]。siRNA是兩端各有2個堿基突出并小于25個堿基對的雙鏈RNA。采用RNAi技術在多種白血病細胞系中封閉白血病特異癌基因的表達已有報道[8]。因此，通過siRNA技術封閉與腫瘤發生發展相關的miRNA的表達具有良好的研究前景。

miR-155位于21號染色體，由來自于B細胞整合簇上非編碼RNA的外顯子轉錄而形成[9-11]，在小兒Burkitt淋巴瘤的表達水平遠遠高于正常。Yamanaka等[12]研究進一步發現，miR-155在淋巴瘤中的治療具有良好的應用前景。另有研究發現NK細胞淋巴瘤高表達miR-155，并進而導致了PTEN、PDCD4和SHIP1低表達以及AKT(Ser473)高磷酸化，通過反義寡核苷酸干擾miR-155表達后可提高PTEN、PDCD4和SHIP1表達，下調AKT(Ser473)磷酸化，抑制腫瘤增殖，提示miR-155在淋巴瘤發病及治療方面有重要作用[13]。阿糖胞苷是一種細胞周期特異性藥物，通過干擾細胞增殖S期的嘧啶類代謝，抑制細胞增殖。阿糖胞苷進入人體后經激酶磷酸化為阿糖胞苷三磷酸及阿糖胞苷二磷酸，前者可抑制 DNA 聚合酶的合成，后者則抑制二磷酸胞苷轉變為二磷酸脫氧胞苷，從而抑制細胞 DNA 聚合及合成[14]。研究報道，caspase-3是miR-155的靶點[15]。

本研究通過應用miR-155 siRNA和Ara-C單獨及聯合作用于Raji細胞，觀察miR-155 siRNA能否增強Ara-C對Raji細胞的增殖凋亡作用。在本研究中，將miR-155 siRNA轉染至Raji細胞后能顯著干擾miR-155的表達。接著通過CCK-8檢測發現，miR-155 siRNA與Ara-C聯合作用較單獨使用miR-155 siRNA或Ara-C有更明顯的抑制增殖作用。為了探討聯合作用對Raji細胞凋亡的影響，行流式細胞術檢測發現，聯合使用miR-155 siRNA能顯著增強Ara-C單獨使用時誘導Raji細胞凋亡的作用。具體機制則與miR-155 siRNA通過抑制miR-155表達而上調caspase-3的表達有關，與文獻報道一致[15]。

綜上所述，miR-155 siRNA與阿糖胞苷聯合作用于Raji細胞可增強阿糖胞苷的抑制增殖作用及促凋亡作用。本研究結果為今后臨床Burkitt 淋巴瘤治療研究提供基礎依據。

[參 考 文 獻]

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