馬鈴薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的篩選及鑒定

王涵琦，暢 濤，楊成德，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070)

馬鈴薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的篩選及鑒定

王涵琦，暢 濤，楊成德*，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070)

采用對峙培養(yǎng)法對馬鈴薯炭疽病的拮抗菌株進(jìn)行了篩選和鑒定。結(jié)果表明，拮抗菌株ZHA10對炭疽病病原菌具有良好的抑制作用，抑制率達(dá)76.43%，其可以使病原菌菌絲變形和裂解；ZHA10菌體短桿狀、革蘭氏陽性、大小為(0.5～0.75)μm × (1.5 ～3.1)μm、芽胞中至尖端生。通過生理生化測定、16S rDNA以及gyrB序列分析，鑒定ZHA10為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。此外，ZHA10還對番茄早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumoxysporum)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)均具有較強(qiáng)的拮抗作用。ZHA10抑菌能力良好，抑菌譜寬，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的潛力。

炭疽病； 生防菌株； 篩選； 鑒定

生物防治(biological control)是指利用有益生物及其生物代謝產(chǎn)物對植物病害進(jìn)行有效防治，從而為生產(chǎn)者、消費(fèi)者和環(huán)境降低風(fēng)險，提高利益[1]。目前，用于植物病害生物防治的生防因子主要有真菌、細(xì)菌、放線菌和病毒等。研究報道，生防真菌木霉已用于防治花生立枯病菌、水稻紋枯病菌、水稻惡苗病菌、辣椒炭疽病菌、白術(shù)白絹病菌等多種植物病害以及蔬菜根腐病等土傳病害[2]。 生防細(xì)菌則主要有芽胞桿菌(Bacillus)[3]、假單胞桿菌(Pseudomonas)、土壤放射桿菌[Agrobacteriumradiobacter(Beijerinck and van Delden) Conn][4-5]等。以芽胞桿菌開發(fā)的Companio、HiStickN/TKo-diak和Serenade,以假單胞菌開發(fā)的BioJect Spot-Less、Bio-save、BlightBan和Cedomon,以放射性農(nóng)桿菌開發(fā)的Galltrol和Nogall可控制多種植物病害[6]。馬鈴薯炭疽病由半知菌亞門炭疽菌屬的球炭疽菌引起，病菌抗逆能力強(qiáng)，存活時間較長[7]。該病是近年甘肅省馬鈴薯種植區(qū)的一種主要病害，能夠侵染馬鈴薯的各個部位，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。有關(guān)馬鈴薯炭疽病生物防治的方法未見文獻(xiàn)報道，故本試驗(yàn)擬從高寒草地牧草內(nèi)生菌中篩選出對馬鈴薯炭疽病具有良好防效的生防細(xì)菌并鑒定，以期為馬鈴薯炭疽病的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

指示菌：馬鈴薯炭疽病菌[Colletotrichumcoccodes(Wallr.)Hughes]、馬鈴薯干腐病菌[Fusariumoxysporum(Mart.)Sacc.]、黃瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen)、孜然根腐病菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]、馬鈴薯褐腐病菌[Stysanusstemonitis(Smith) Smith]、小麥根腐病菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.)Subram.Gain.]、番茄早疫病菌[Alternariasolani(EllisetMartin) JonesetGrout]，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試拮抗菌株：土壤細(xì)菌B1和B2；401、ZHA10、ZA1、TY、XA7、ZHA4、T4、ZB2、ZHC11、ZHA9、ZA14和402等從149株高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌中初篩出的拮抗菌株，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

將供試菌株與指示菌分別接于牛肉胨、PDA平板上活化后，用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅。取指示菌一塊置于平板中央，在距中央3 cm的圓周上等距離接4塊供試菌株(即對峙法)，重復(fù)3次，后置于28 ℃下培養(yǎng)，對照滿皿后，十字法測量菌落直徑，重復(fù)3次，計(jì)算抑制率。并分別挑取處理組和對照組病原菌菌落邊緣的菌絲體，制片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)的變化并拍照。

抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-原菌餅直徑)×100。

1.2.2 抑菌譜測定

采用對峙培養(yǎng)法，測定拮抗菌對幾種病原菌的抑菌能力，方法同1.2.1。

1.2.3 生防菌株的生理生化鑒定

1.2.3.1培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

拮抗菌活化后分別接種于NA斜面、平板及NB培養(yǎng)液，于28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察培養(yǎng)性狀。將拮抗菌在牛肉胨平板上活化培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行革蘭氏染色和芽胞染色[9]，觀察菌體和測量菌體的長度及寬度(30個)，并顯微拍照。

1.2.3.2生理生化測定

具體方法參照《常見系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]進(jìn)行。

1.2.3.316S rDNA序列分析

按上海生工提供的試劑盒(Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒)提取DNA并檢測，對具有特異性DNA條帶樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

使用引物1(5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′)和引物2(5′-CGGGATCCT ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后在68 ℃下延伸7 min，終止反應(yīng)。反應(yīng)體系：10×buffer(含MgCl2)5 μL，dNTP (2.5 mmol/L)1 μL。primer 1(10 μmol/L)1 μL，primer 2 (10 μmol/L)1 μL，Taq poly-merse (2 U/μL)0.4 μL, Target DNA (10 ng/μL)1 μL，ddH2O 40.6 μL，總體積為50 μL。經(jīng)檢測，將具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司測序，所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的序列進(jìn)行相似性比較(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較，再用Mega(4.0)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，確定拮抗菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.3.4gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

gyrB基因序列分析使用引物UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTG-GAAAGTTCGA-3′)和引物UP-2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGCGTC-AGTCAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增[21]。擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，Taq酶 1 μL，UP-1 1 μL，UP-2 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 15.5 μL，總體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃保持1 h。其他方法同1.2.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

結(jié)果表明，菌株TY和ZA14等菌株與炭疽菌重疊生長，無拮抗作用；ZHA4和402菌株與炭疽菌之間沒有明顯的界線，但菌落內(nèi)炭疽菌不能生長，營養(yǎng)競爭作用明顯；B1、B2、T4、401、ZA1、XA7、ZHA10、ZHC11、ZB2和ZHA9菌落周圍有明顯的抑菌圈，抑菌作用明顯，且抑制率均在70%以上，B1、B2和ZHA10對馬鈴薯炭疽病菌抑制率均在76%以上(表1)。ZHA10為高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌，其可能具有較強(qiáng)的耐低溫性，有利于馬鈴薯窖藏期低溫時期應(yīng)用，因此本試驗(yàn)選用高寒草地內(nèi)生細(xì)菌ZHA10為研究對象進(jìn)行以下試驗(yàn)。

表1供試強(qiáng)拮抗菌株對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果

Table1TheinhibitionofColletotrichumcoccodesbytheantagonists

拮抗菌Antagonisticbacterium菌落直徑/cmDiameterofcolony抑制率/%InhibitionrateB22．32±0．00176．43bT42．59±0．01272．85de4012．54±0．00573．57cdeZA12．43±0．00275．00bcXA72．65±0．02472．14eB12．10±0．00279．29aZHA102．32±0．00576．43bZHC112．48±0．06074．29cdZB22．87±0．00569．29fCK8．21±0．013-

圖1 B1、B2和ZHA10對炭疽菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic reaction of the strains B1,B2 and ZHA10 against Colletotrichum coccodes

用ZHA10處理馬鈴薯炭疽菌后，炭疽菌菌絲生長形態(tài)異常，出現(xiàn)膨大、扭曲現(xiàn)象，菌絲內(nèi)的原生質(zhì)發(fā)生凝集，菌絲頂端和中部出現(xiàn)泡狀物，菌絲的泡狀物破裂，原生質(zhì)外溢。對照菌絲光滑，均勻(圖2)。

2.2 抑菌譜測定

在測試的7種病原真菌中，ZHA10對馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯干腐病菌和番茄早疫病菌的抑制效果良好，抑制率分別是72.62%、72.28%和70.38%；對孜然根腐病菌、小麥根腐病菌、黃瓜枯萎病菌和馬鈴薯褐腐病菌的抑制效果次之，但也在60%以上(表2)。說明ZHA10對馬鈴薯的多種病原菌有很好的抑制作用。其抑菌譜寬，在馬鈴薯病害生物防治中潛力大。

表2ZHA10對其他病原真菌的抑制作用

Table2AntagonisticspectrumofZHA10againstpathogens

供試病原菌Pathogenicfungus菌落直徑/cmDiameterofcolony對照/cmCK抑制率/%Inhibitionrate孜然根腐病菌Fusariumsolani2．957．4565．45小麥根腐病菌Bipolarissorokiniana3．357．7761．63黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum3．508．0761．16番茄早疫病菌Alternariasolani2．557．1870．38馬鈴薯干腐病菌Fusariumoxysporum2．688．1272．28馬鈴薯褐腐病菌Stysanusstemonitis2．336．2563．30馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichumcoccodes2．316．8372．62

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

拮抗菌株ZHA10為革蘭氏陽性，短桿狀(圖3左)，芽胞中至尖端生(圖3右)，菌體大小為(0.5～0.75)μm×(1.5～3.1)μm。在NA平板上，菌落扁平，大小為0.5 cm，呈不規(guī)則狀，邊緣裂片狀，顏色乳白色，邊緣乳黃色。有黏性，質(zhì)軟，菌落不透明。

圖3 ZHA10革蘭氏染色(左)和芽胞染色(右)(20×100)Fig.3 Gram staining (left) and spore staining (right) of ZHA10

2.3.2 生理生化特征

生理生化結(jié)果表明，ZHA10菌株在厭氧條件下可以生長；最高生長溫度為40 ℃，最低生長溫度為15 ℃，最適宜生長溫度為25～30 ℃；可以在pH6.8和pH5.7的營養(yǎng)肉湯中生長；能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸；可以使明膠液化；能水解淀粉和還原硝酸鹽；不能利用丙二酸鹽；V-P測定為陽性；具有耐鹽性,可以在10% 的NaCl培養(yǎng)基中生長；接觸酶、酪朊水解呈陽性, 苯丙氨酸脫氨酶、酪胺酸水解均呈陰性。經(jīng)與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對照，上述特征均符合芽胞桿菌生理生化特征，初步鑒定ZHA10為芽胞桿菌。

2.3.3 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株ZHA10的序列長度為 1 451個堿基序列。經(jīng)Blast相似性分析，菌株ZHA10與多株芽胞桿菌屬菌株相似度均達(dá)到99%以上，用MEGA version 4.0將菌株ZHA10與來自 GenBank的5株不同種芽胞桿菌一起構(gòu)建基于 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 4)，結(jié)果顯示，ZHA10與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)GQ861467、芽胞桿菌(Bacillussp.)EU442608聚在一起，說明ZHA10與枯草芽胞桿菌遺傳距離更近，結(jié)合生理生化結(jié)果初步鑒定ZHA10為枯草芽胞桿菌。

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的ZHA10 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZHA10

2.3.4 gyrB序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對菌株ZHA10的gyrB序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到的片段長度為1 000個堿基序列。用BLAST軟件經(jīng)相似性比較，結(jié)果表明ZHA10與已報道的Bacillussubtilis(JX282194)和Bacillussubtilis(JQ653052)等菌株的相似性在99%以上。用Mega(4.0)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，ZHA10與Bacillussubtilis(JX282194)最近(圖5)。菌株ZHA10的形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征與枯草芽胞桿菌一致，結(jié)合基于 16S rDNA 序列和gyrB序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，將菌株ZHA10鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

圖5 ZHA10的gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of ZHA10 gyrB

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯的種植面積日益擴(kuò)大，其病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重，尤其是馬鈴薯儲藏期的病害。對儲藏期的病害不宜進(jìn)行化學(xué)防治，而生物防治具有定殖能力強(qiáng)，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，適合防治儲藏期馬鈴薯炭疽病的發(fā)生，這與趙妍，穆常青[14-15]研究表明枯草芽胞桿菌能夠有效控制采后水果的多種疫病一致。目前研究也已經(jīng)證明了枯草芽胞桿菌是一種理想的生防細(xì)菌[16-18]。

由于細(xì)菌16S rDNA具有高度保守性，對相似率極高的近緣種無法做進(jìn)一步區(qū)分[19]，其平均堿基替換率為每5 000萬年變化1%，比gyrB基因的堿基替換率每100萬年變化0.7%～0.8%要慢[20]，在比較一些相似性比較高的近緣種時，gyrB基因更能準(zhǔn)確地鑒定到種。因此，本試驗(yàn)通過16S rDNA、gyrB基因序列相似性分析、菌體形態(tài)觀察及生理生化測定結(jié)果，將ZHA10鑒定為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，而這種鑒定細(xì)菌的方法也是一種快速鑒定的方法。

本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室保存的土壤細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌中篩選并獲得了對馬鈴薯炭疽病具有高效拮抗作用的菌株ZHA10，在平板對峙試驗(yàn)中其抑制率達(dá)72.62%，抑菌機(jī)制主要是使病原菌菌絲變形、裂解。同時對早疫病菌、褐腐病菌、干腐病菌等馬鈴薯病原菌具有良好的抑制作用。所以，ZHA10在馬鈴薯病害的生物防治方面具有較好的利用價值，且該拮抗菌分離自高寒草地牧草體內(nèi)，具有良好的抗(耐)低溫特性，在防治馬鈴薯貯藏期病害中也具有優(yōu)勢。該拮抗菌雖然在室內(nèi)抑菌能力較強(qiáng)，但是，其在大田防治效果、發(fā)酵工藝以及在植物體內(nèi)定殖情況等方面還需進(jìn)一步研究。

[1] Cecilia Mónaco, Marina Sisterna, Analía Perelló,et al.Preliminary studies on biological control of the black point complex of wheat in Argentina[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2004,20: 285-290.

[2] 邱德文.我國植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J].植物保護(hù),2010,36(4):15-18.

[3] 胡燕梅,楊龍.利用微生物防治植物病害的研究進(jìn)展[J].中國生物防治,2006,10(S1):190-192.

[4] Bergt G, Ballin G.Bacterial antagonists toVerticilliumdahliaeKleb[J].Journal of Phytopathology,1994,141:99-110.

[5] Kumar L P, Nranjana S R, Prakash H S, et al.Effect ofPseudomonasfluorescensagainstPyriculariagriseain rice[J].Crop Improvement,2000,27(2): 159-166.

[6] 齊愛勇，趙緒生，劉大群.芽孢桿菌生物防治植物病害研究現(xiàn)狀[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2011,27(12):277-280.

[7] Hooker W J.Compendium of potato diseases[M].Washington: the American Phytopathological Society,2003:26.

[8] 楊成德,姜紅霞,陳秀蓉,等.甘肅省馬鈴薯炭疽病的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J].植物保護(hù),2012,38(6)：127-133.

[9] 汪遠(yuǎn), 詹儒林, 何紅, 等.紅樹內(nèi)生細(xì)菌菌株Kc-38的抗菌物質(zhì)及對采后芒果炭疽病的防效[J].中國生物防治學(xué)報, 2011, 27(1): 82-87.

[10]東秀珠, 蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[11]布坎南 R E,吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版.北京: 科學(xué)出版社, 1981.

[12]方中達(dá).植病研究方法[M].第三版.北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997.

[13]Yamamoto S,Harayama S.PCR amplification and direct sequencing ofgyrBgenes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis ofPseudomonasputidastrains[J].Applied Environmental Microbiology, 1995, 61: 1104-1109.

[14]趙妍,邵興鋒,屠康,等.枯草芽孢桿B10對采后草莓果實(shí)病害的抑制效果[J].果樹學(xué)報, 2007, 24(3): 339-343.

[15]穆常青.枯草芽孢桿菌B-332菌株及其抗菌物質(zhì)對稻瘟病的生防作用研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2006:8-10.

[16]張學(xué)君，趙軍，王金生.枯草芽孢桿菌B3菌株對小麥根系和莖基部的定殖作用研究[J].生物防治通報，1994(4):171-174.

[17]李德全，陳志誼，聶亞峰.生防菌Bs-916及高效突變菌株抗菌物質(zhì)及其對水稻抗性誘導(dǎo)作用的研究[J].植物病理學(xué)報,2008,38(2):192-198.

[18]Bais H P， Fall R, Vivaneo J M.Biocontrol ofBacillussubtilisagainst infection of Arabidopsis roots byPseudomonassyringaeis facilitated by biofilm formation and surfactin production[J].Plant Physiology,2004,134:307-319.

[19]Wang L, Lee F, Tai C, et al.Comparison ofgyrBgene sequences,16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillussubtilisgroup[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007,57: 1846-1850.

[20]李獻(xiàn)梅,王小芬,楊洪巖,等.促旋酶(gyrase)B亞單位基因gyrB在鑒別細(xì)菌近緣種中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,2008,48(5): 701-706.

ScreeningandidentificationoftheantagonisticorganismsagainstColletotrichumcoccodesonpotato

Wang Hanqi，Chang Tao，Yang Chengde，Chen Xiurong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity；KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemUniversity,MinistryofEducation；PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince；Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

In this study, the biocontrol strain ofColletotrichumcoccodeson potato was screened by confrontation culture method.The results showed that the strain ZHA10 had good inhibition againstC.coccodes, and the inhibition rate reached 76.43%.In order to understand the bacteriostatic mechanism of the endophytic strain ZHA10 toC.coccodesand its taxonomic status, a series of physiological and biochemical experiments were conducted.The results showed that the antibacterial activity was mainly due to hyphal deformation and cracking.ZHA10 was short rod-shaped, gram-positive, and (0.5-0.75) μm×(1.5-3.1)μm in size, with endospores growing from the center to the tip.Through 16S rDNA andgyrBgene sequence analysis, ZHA10 was identified asBacillussubtilis.Besides, ZHA10 could effectively inhibit the growth ofAlternariasolani,Fusariumoxysporum,Fusariumsolani,Bipolarissorokiniana,FusariumoxysporumandStysanusstemonitis, which showed that ZHA10, with broad spectrum and high antagonistic activity against pathogenic fungi, had good potential for development and application.

Colletotrichumcoccodes; biocontrol strain; screening; identification

2013-05-24

： 2013-08-27

國家自然科學(xué)基金(31160122)

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.006

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn