甘肅省馬鈴薯枯萎病(Fusariumavenaceum)鑒定及其病原生物學特性

王玉琴，楊成德，陳秀蓉，薛 莉，蘇建紅

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室，

甘肅省馬鈴薯枯萎病(Fusariumavenaceum)鑒定及其病原生物學特性

王玉琴，楊成德*，陳秀蓉，薛 莉，蘇建紅

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室，

中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，蘭州 730070)

對甘肅省馬鈴薯枯萎病菌進行了分離、鑒定及培養特性的研究。結果表明，該病原菌大型分生孢子鐮刀形，無色，多細胞，大小為(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子數量較多，無色，卵圓形或橢圓形，大小為(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm；ITS序列分析表明，病原菌與Fusariumavenaceum(JN6317483)親緣關系最近，相似性達到100%，結合形態特征鑒定該病原菌為燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)。該病原菌在5～40 ℃范圍內均可生長，最適溫度為20 ℃；供試的碳、氮源中，果糖和亮氨酸對該菌菌絲生長有顯著的促進作用(P<0.05)，而顯著抑制菌絲生長的是氯醛糖和碳酸銨(P<0.05)；不同類型培養基中，燕麥片培養基對菌絲生長有顯著促進作用(P<0.05)。

馬鈴薯； 枯萎病； 鑒定； 培養性狀

馬鈴薯作為一種塊莖類糧蔬兼用食品，具有重要的營養價值和經濟價值[1-2]。甘肅是我國馬鈴薯主要產區之一，馬鈴薯在全省各地均有種植，并以中部干旱區、高寒陰濕二陰區為中心，形成隴南濕潤山區至河西灌區東部連成一片的馬鈴薯主產區[3]。近年來，隨著馬鈴薯種植面積不斷擴大，病害種類不斷增多，危害逐年加重，嚴重制約馬鈴薯生產及其加工產業的健康發展。據報道，世界范圍內馬鈴薯真菌性病害已有33種，在我國危害較重、造成損失較大的有10余種[4]，2010年在甘肅省馬鈴薯產區調查時發現疑似馬鈴薯枯萎病發生。馬鈴薯枯萎病菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘體在土壤中或病薯上越冬。翌年病部產生的分生孢子借雨水或灌溉水傳播，從傷口侵入。田間濕度大、土溫高于28 ℃或重茬地、低洼地易發病[5]。因此，本試驗以傳統的形態學特征結合rDNA-ITS序列分析，從分子生物學水平上明確甘肅省馬鈴薯枯萎病的病原，并且研究了其培養性狀，以期為該病的田間診斷和綜合防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 大田癥狀描述及病原分離與純化

在武威市天祝縣和定西市對典型枯萎病癥狀進行描述后，采集馬鈴薯莖稈和薯塊帶回實驗室，按照常規的組織分離法分離病菌，在PSA培養基(馬鈴薯200 g，蔗糖15 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL)上進行培養與純化，將純化獲得的菌株黑暗培養，待產孢后進行單孢分離，進一步純化后移入PSA斜面培養保存備用[6]。

1.2 致病性測定

將產孢的供試菌株用無菌水配制成孢子懸浮液(約 106個/mL)，在室溫條件下，采用灌根法將分生孢子懸浮液均勻澆灌在種有健康新大坪塊莖的滅菌土壤中，3次重復，以無菌水為對照。等長出幼苗后，連續觀察馬鈴薯的發病情況，形成典型癥狀后，對病原菌進行再分離，按柯赫氏法則確定病原菌[7]。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態學鑒定

將菌株培養產孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子特征，測定100個分生孢子的大小，并在顯微鏡下拍照[8]。根據病原菌形態特征，參考相關文獻[9]進行病原菌種的鑒定。

1.3.2 rDNA-ITS的擴增與序列分析

1.3.2.1DNA的提取

將供試菌株接種于PDB液體培養基中，于25 ℃下培養7～9 d后收集菌絲，充分研磨后，用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取DNA，經電泳檢測具特異性條帶的DNA提取物進行PCR擴增。

1.3.2.2PCR擴增

采用通用引物ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。其擴增體系為：10×PCR Buffer 5.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL) 1.2 μL，引物ITS1(10mmol/L)和ITS4(10mmol/L)各2.0 μL，dNTP(10mmol/L)3.0 μL， DNA模板(10 ng/μL)2.0 μL，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min[10]。取0.4 μL的PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物有限公司進行DNA純化和測序，將測序結果與GenBank中核酸數據庫中的ITS區相關序列進行同源性比較，明確其系統發育地位。

1.4 生物學特性研究

1.4.1 不同溫度對菌絲生長的影響

采用生長速率法。將已經活化好的病原菌用0.4 cm直徑的打孔器切取菌餅，置于PSA平板中央，置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和45 ℃下培養，重復5次，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，并對所得數據用SPSS軟件進行方差分析。

1.4.2 不同碳氮源對菌絲生長的影響

在含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-樹膠醛糖、麥芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、 D-果糖、不加糖)以及在含0.2%葡萄糖的馬鈴薯瓊脂培養基中加入0.25%氮源(氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、硝酸鈉、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-組氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸、不加氮源)培養基上培養菌株，20 ℃下培養，分別以不加碳氮源為對照[11]，其他同1.4.1。

1.4.3 不同培養基對菌絲生長的影響

在不同培養基(燕麥片、理查固體、麥芽糖、玉米粉、PDA、查彼固體、PSA、麥芽瓊脂、孟加拉紅瓊脂、水瓊脂共10種，參考文獻[6]配制)上培養病原菌，3次重復，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑， 其他同1.4.1。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

馬鈴薯枯萎病在生長期及貯藏期均可發病。生長期首先從植株下部葉片出現萎蔫，逐漸向上擴展，初期早晚可恢復，中午萎蔫(圖1-a、b)；植株莖部維管束變褐色，嚴重時全株枯死(圖1-c)；塊莖發病時，塊莖上多呈現表面斑點，剖開病薯，可看到從蒂部維管束開始變褐色和擴展(圖1-d)。貯藏期塊莖發病癥狀與生長期一致(圖1)。

圖1 馬鈴薯枯萎病癥狀Fig.1 Symptoms of potato wilt

2.2 病原菌的分離及致病性測定

從多個發病薯塊上采用常規組織分離法分離獲得多個真菌分離物，但其培養性狀及菌絲形態均一致，因此合并為一個真菌分離物。將該真菌分離物的懸浮液接種于種植健康馬鈴薯塊莖的無菌土壤中，經連續觀察，在馬鈴薯生長中后期開始發病，植株萎蔫(圖2-b)，剖開莖稈，莖稈維管束變褐；切開塊莖，可見其內維管束組織變褐(圖2-c、d)，其發病癥狀與田間癥狀一致(圖2)。從發病莖稈和塊莖上均可再分離得到與原接種菌株相同的真菌分離物。根據柯赫氏法則，確定該分離物為馬鈴薯枯萎病的致病菌株。

圖2 病原致病性測定Fig.2 Pathogenicity test of the pathogen tested

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌的形態特征

病原菌在PSA培養基上菌落粉紅色、桃紅色，菌落隆起，繁茂(但非稀疏)，較厚，致密，菌落中部為橙黃色層，四周菌絲白色，菌背紫紅色(圖3-a、b)。分生孢子無色透明，大型分生孢子鐮刀形，稍彎曲，兩端漸細，具2～5個隔膜，多為3個，大小為(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子長橢圓形、腎形，單孢、雙孢，大小(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm，數量較多(圖3-c、d)。根據形態學特征，參考相關文獻[12-13]，將病原菌初步鑒定為鐮孢屬真菌(Fusariumsp.)。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析

提取該病原菌的基因組DNA，經電泳檢測具特異性條帶(圖4)，可以進行PCR擴增。利用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，擴增產物用1.2% 瓊脂糖凝

膠電泳檢測，以DNA Marker-DL2000為對照，在500 bp附近有一條明顯的擴增條帶，與預期ITS rDNA目的片段大小相符(圖5)，將該擴增產物送上海生工測序，所得ITS-rDNA序列為553 bp。登錄Internet網(http:∥www.ncbi.nlm.nih gov/blast.cgi)，將菌株的rDNA-ITS基因序列在GenBank中進行同源序列比較，該病原菌與GenBank中各菌株F.acuminatum(JX114788)、F.oxysporum(EU520062)、Gibberellaavenacea(GU934530)、F.avenaceum(JN631748)、F.tricinctum(JX179207)、G.avenacea(EU255796)的相似性都在99%以上，下載相似性最高的序列，并用ClustalX(1.8)軟件進行多重序列比較后，再用Mega(4.0)軟件采用鄰接法構建了系統發育樹，該病原菌與燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)(JN631748)聚在一起(圖6)，即其親緣關系最近，結合形態學特征，進一步鑒定其為燕麥鐮孢菌(Fusariumavenaceum)。

圖3 病菌形態特征Fig.3 Morphological characters of the pathogen

圖4 DNA的提取Fig.4 DNA extraction

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響

試驗結果表明(圖7)，病原菌在5～40 ℃范圍內均可生長，20 ℃時菌落生長速率顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，為最適生長溫度，5～20 ℃之間隨溫度增加菌絲生長速率增加，高于20 ℃，菌落生長速率逐漸下降，在0 ℃和45 ℃下均不能生長。

2.4.2 碳源對菌絲生長的影響

表1表明，以果糖為碳源菌絲生長最快，其次為木糖、麥芽糖、甘露糖，4種碳源間無顯著差異，但均顯著高于其他碳源(P<0.05)，且麥芽糖、甘露糖與D-半乳糖差異極不顯著(P<0.01)；菌絲生長速度最慢的是氯醛糖，氯醛糖與蔗糖、可溶性淀粉和CK差異不顯著(P<0.05)，且與乳糖、樹膠醛糖、CK、可溶性淀粉、蔗糖差異極不顯著(P<0.01)。

圖5 ITS-rDNA序列的擴增Fig.5 PCR product of ITS-rDNA

圖6 病原菌的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Fusarium sp.based on the sequences of 16S rDNA

圖7 溫度對菌絲生長的影響Fig.7 Effects of temperature on mycelial growth of Fusarium avenaceum

2.4.3 氮源對菌絲生長的影響

表1表明，與對照相比，亮氨酸對該菌菌絲生長有顯著的促進作用(P<0.05)；氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉對菌絲生長也有促進作用，但與對照差異不顯著。大豆蛋白胨、蛋白胨、L-谷酸氨、甘氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、尿素、碳酸銨對該菌的生長有抑制作用，其中碳酸銨，尿素顯著抑制該菌生長(P<0.05)，但尿素與L-精氨酸的差異不顯著(P<0.05)，且與L-精氨酸、L-組氨酸、甘氨酸的差異極不顯著(P<0.01)。

表1不同碳、氮源對菌絲生長的影響

Table1Effectsofcarbon-sourceandnitrogen-sourceonthemycelialofFusariumavenaceum

碳源C?source菌落直徑/cmColonydiameter氮源N?source菌落直徑/cmColonydiameterD?果糖D?fructose7．72aAD?木糖D?xylose7．43aA麥芽糖Maltose7．36aAB甘露糖Mannose7．35aABD?半乳糖D?galactose5．84bBC葡萄糖Glucose5．80bC乳糖Lactose5．47bcCDD?樹膠醛糖D?gummose5．31bcCDCK(不加糖)5．15bcdCD可溶性淀粉Solublestarch4．78bcdCD蔗糖Sucrose4．45cdCD氯醛糖Chloralose4．03dD亮氨酸Leucine8．04aA 氯化銨Ammoniumchloride7．36abAB硝酸銨Ammoniumnitrate7．27abAB硝酸鈉Sodiumnitrate7．04abcABCK6．88bcAB大豆蛋白胨Soybeanpeptone6．16bcdBC蛋白胨Peptone6．08cdBCL?谷氨酸Glutamicacid5．22deCD甘氨酸Glycine5．01deCDEL?組氨酸L?histidine5．00deCDEL?精氨酸L?arginine4．36efDE尿素Urea3．57fE碳酸銨Ammoniumcarbonate0．4gF

1) 標小寫字母者表示在P<0.05水平差異顯著，標大寫字母者表示在P<0.01水平差異顯著。下同。 The different letters indicate significance atP<0.05 andP<0.01 levels in different media forFusariumavenaceum.The same below.

2.4.4 不同培養基對菌絲生長的影響

從表2可知，不同培養基上菌落的生長速率依次為：燕麥片>理查固體>麥芽糖>玉米粉>PDA>查彼固體>PSA>麥芽瓊脂>孟加拉紅瓊脂>水瓊脂，且在燕麥培養基上菌落的生長速率顯著高于其他培養基(P<0.05)，即燕麥片培養基有利于該病原菌菌絲的生長；菌絲在水瓊脂培養基上生長速率顯著低于其他培養基(P<0.01)。

表2不同培養基對菌絲生長的影響

Table2EffectsofmediaonmycelialgrowthofFusariumavenaceum

培養基Medium菌落直徑/cmColonydiameter培養基Medium菌落直徑/cmColonydiameter燕麥片Oatmeal7．87aA理查固體Richardsolid6．84bAB麥芽糖Maltose6．80bAB玉米粉Maizemedium6．44bcBCPDA6．26bcdBC查彼固體Czapekmedium5．55cdeBCDPSA5．34deCDE麥芽瓊脂Maltagar4．82efDE孟加拉紅瓊脂Rosebengalagar4．24fEF水瓊脂Wateragar3．05gF

3 討論

據Rakhimov和Khakimov報道[14]，馬鈴薯枯萎病是由鐮刀菌的5 個不同種引起的，即茄病鐮刀菌[Fusariumsolani(Mart.)]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)、串珠鐮刀菌(F.moniliformeSheld.)、雪腐鐮刀菌[F.nivale(Fr.)Ces.]、接骨木鐮刀菌(F.sambucinumFuck.)。彭學文等[15]報道，河北省馬鈴薯枯萎病是由茄病鐮刀菌(F.solani)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)以及尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)引起的。薛玉鳳等[16]報道，內蒙古地區發現的馬鈴薯枯萎病病原菌有尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)和三線鐮刀菌[F.tricinctum(Fr.)Sacc.]。王曉麗等[17]對馬鈴薯枯萎病初侵染來源及栽培與發病的關系進行了研究，得到合理施肥均能延緩植株發病，采用覆膜起壟栽培可以有效降低病薯率。但是，為有效控制馬鈴薯枯萎病的發生，必須清楚引起病害發生的病原菌種類，以及發病條件，進而制定有效的防治措施。

本試驗通過病原分離、致病性測定以及形態學鑒定、ITS序列分析等方法，將分離自武威市天祝縣和定西市的馬鈴薯枯萎病菌鑒定為燕麥鐮刀菌，此為首次報道該種可以引起馬鈴薯枯萎病。生物學研究表明，該病原菌能夠在5～40 ℃條件下生長，生長的最適溫度為20 ℃，溫度過高或過低對菌絲生長均不利，此結果可為該病害的防治提供理論依據。該病原菌的菌絲在5～10 ℃條件下均可緩慢生長，但差異不顯著，此結果說明在貯藏條件下，馬鈴薯枯萎病仍有可能發病，為馬鈴薯貯藏期病害防治提供了一定依據。

不同碳、氮源對菌絲生長的影響存在顯著差異。在供試碳氮源中，最佳碳源是果糖和木糖、麥芽糖、甘露糖，最佳氮源是亮氨酸，氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉對菌絲生長也有促進作用，但差異不顯著，碳酸銨、尿素、L-精氨酸抑制該病原菌的生長。根據不同碳、氮源對菌絲生長的影響，在實際生產中可以使用對病原菌生長有顯著抑制作用的碳氮源作為肥料，減緩病害的發生。

馬鈴薯枯萎病病原方面僅王麗麗[2]報道了新疆烏昌地區有該病害發生，本文首次確認了燕麥鐮刀菌可以引起馬鈴薯枯萎病，并詳細研究了其生物學特性，為該病害的田間診斷和綜合防治提供了依據。

[1] 魏延安.世界馬鈴薯產業發展現狀及特點[J].世界農業,2005(3):29-32.

[2] 王麗麗, 日孜旺古麗·蘇皮,李克梅,等.烏昌地區馬鈴薯真菌性病害種類及5種新記錄[J].新疆農業科學,2011，48(2):266-270.

[3] 王一航.甘肅省馬鈴薯產業發展的優勢及必須重視解決的幾個問題[J].甘肅農業科技,2002(4):3-6.

[4] 李濟宸.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊:河北科學技術出版社,1992:24-57.

[5] Stevenson W R, Loria R, Franc G D, et al.Compendium of potato diseases[M].Minnesota: APS Press, 2004:25-26.

[6] 方中達.植病研究方法[M].北京:中國農業出版社,2003.

[7] 徐志剛.普通植物病理學[M].第四版.北京：高等教育出版社,2009.

[8] 柳風,楊順錦,詹儒林,等.澳洲堅果葉斑病病原鑒定及其生物學特性[J].植物保護學報,2011,38(5): 437-442.

[9] 戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京:科學出版社,1979.

[10]楊秀梅,王繼華,王麗花,等.百合枯萎病病原鑒定與ITS序列分析[J].西南農業學報,2010,23(6):1914-1916.

[11]陳秀蓉,南志標,楊成德,等.牧草根際3種平臍蠕孢菌培養性狀及對營養的利用能力[J].草業學報,2005,14(5):99-104.

[12]Nelson P E, Toussoun T A, Burgess L W, et al.Isolating,identifying and producing inoculum of pathogenic species ofFusarium[C]∥Hickey K D．Methods for evaluating pesticides for control of plant pathogens．St.Paul: APS Press,1986: 54-59．

[13]王拱辰.常見鐮刀菌鑒定指南[M].北京:中國農業出版社,1996.

[14]Rakhimov U Kh, Khakimov A Kh.Wilt of potatoes in Uzbekistan[J].Zashchital Karantin Rastenii, 2000, 3: 46.

[15]彭學文,朱杰華.河北省馬鈴薯真菌病害種類及分布[J].中國馬鈴薯,2008,22(1): 31-33.

[16]薛玉鳳,蒙美蓮,胡俊,等.6 種殺菌劑對馬鈴薯枯萎病菌的室內毒力測定[J].中國馬鈴薯,2012，26(4):228-230.

[17]王曉麗,蒙美蓮,薛玉鳳,等.馬鈴薯枯萎病初侵染來源及栽培與發病的關系[J].中國馬鈴薯,2012,26(3):169-173.

IdentificationofpotatowiltcausedbyFusariumavenaceumandthebiologicalcharacteristicsofitspathogen

Wang Yuqin，Yang Chengde，Chen Xiurong，Xue Li，Su Jianhong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity;KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince;Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The pathogen causing potato wilt were isolated and identified by the rDNA-ITS sequences and biological characteristics in Gansu Province.The results showed that the macroconidia were hyaline, sickle-shaped, multi-cellular, and the size was (12.5-30)μm × (2.5-5)μm.The microconidia were oval, and the size was (4.70-12.94) μm×(1.76-2.35)μm.The rDNA-ITS sequence of the pathogenic fungus shared 100% similarity with that ofFusariumavenaceum(JN6317483).The morphologic characteristics and ITS sequence analysis all indicated that the pathogenic fungus wasF.avenaceum.The suitable culture temperature was from 5 ℃ to 40 ℃, and the optimum was 20 ℃.D-fructose and leucine had significant promoting effect on the growth of the mycelia (P<0.05), and chloralose and ammonium carbonate significantly inhibited mycelial growth (P<0.05).Oatmeal medium played a significant role in promoting mycelial growth (P<0.05).

potato；Fusariumwilt； identification； culture characteristics

2013-04-11

： 2013-06-17

甘肅省農牧廳項目

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.008

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn