小麥品種抗條銹病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測

張玉薇，劉 博，劉太國*，高 利，陳萬權*

(1.云南農業大學，昆明 650201；2.植物病蟲害生物學國家重點實驗室，中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

小麥品種抗條銹病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測

張玉薇1，2，劉 博2，劉太國2*，高 利2，陳萬權2*

(1.云南農業大學，昆明 650201；2.植物病蟲害生物學國家重點實驗室，中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

利用抗條銹病基因Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位的SCAR或STS標記，對2006-2010年75份國家審定的小麥品種進行了分子檢測，以明確Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位在我國2006-2010年審定小麥品種資源中的分布。結果顯示：75份材料中有13份檢測到Yr10基因的標記，1份檢測到Yr18基因的標記，分別占參試材料的17.3%和1.3%，只有‘西農928’能同時檢測到Yr10和Yr18基因；25份含有1BL/1RS易位片段，占參試材料的33.3%。表明1BL/1RS易位在我國小麥育種中利用率仍然較高，對目前流行條銹菌小種有良好抗性，而表現慢銹性的Yr18在小麥育種的利用率較低，建議在我國小麥育種中加強利用。

小麥； 分子標記； 抗條銹病基因； 1BL/1RS易位。

小麥是世界上總產量僅次于玉米的第二大糧食作物，而我國是世界小麥第一大生產國，小麥產量在世界小麥總產量中占有重要比重[1]。2012年聯合國糧農組織發布的《農作物前景和糧食形勢》報告中指出，我國小麥產量預測數據為1.174億t，約占世界小麥產量的17%[2]。近年來，隨著全球氣候變暖等氣候條件的變化，小麥條銹病呈流行趨勢，嚴重威脅著小麥的高產和穩產[3]。選育并推廣抗病品種為防治小麥條銹病最為經濟、安全和有效的方法[4]。

分子標記是一項發展迅速的生物技術，常用于分子輔助選擇育種和快速檢測特定目標性狀基因。它以DNA形式直接表現，不受環境和待測品種的基因表達情況的限制[5]。祁旭升[6]、楊文雄[7]、王欣[8]、曹世勤[9]等眾多專家學者曾利用分子標記對我國小麥品種的抗條銹基因進行研究分析，證實了分子標記在小麥品種抗條銹基因研究中有重要應用價值，現已被廣泛使用。

Yr10最早由Metzger等[10]在小麥種質P.I.178383中發現，是位于小麥1B染色體上的顯性抗病基因，對中國目前出現的大部分條銹菌生理小種都具有良好抗性[11]。邵映田等[12]利用AFLP方法成功地找到了與Yr10緊密連鎖的分子標記，并轉化為穩定的SCAR標記SC200，該SCAR標記與Yr10的連鎖距離為0.5 cM。Yr18是成株抗性基因，與Lr34和Pm38緊密連鎖，慢條銹性表現穩定，具有一定的利用價值[13]。引物sclv34為Yr18的共顯性標記，具有準確性高，重復性好等特點。該標記與Yr18的連鎖距離為2.5 cM[14]，可用于小麥品種Yr18分子標記的輔助選育，Lagudah等[14]、Kolmer等[15]、祁旭升等[6]學者先后利用sclv34對各地小麥種質進行了抗條銹基因Yr18的分子檢測。楊文雄等[14]研究表明，我國農家品種中Lr34/Yr18分布相當廣泛，但在育成品種中只有‘南大2419’、‘內鄉5號’等少數品種含有Lr34/Yr18。

1BL/1RS易位系源于黑麥，具有良好的抗逆性、適應性和豐產性，是外緣種質用于小麥育種最成功的范例[16]。國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)約45%的高代品系屬于該易位類型[17]。1BL/1RS易位片段上帶有抗條銹、稈銹、葉銹和白粉病的基因(Yr9、Sr31、Lr26和Pm8)，曾作為小麥真菌病害的抗源在育種工作中起重要作用[18]。

本研究利用小麥Yr10、Yr18基因和1BL/1RS的SCAR或STS分子標記，對2006-2010年我國國審小麥品種的75份材料進行檢測，以了解這些基因和1BL/1RS易位片段在我國國審小麥品種中的分布，為小麥品種改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試75份小麥品種來自于2006-2010年國家審定小麥品種，陽性對照材料為‘Avocet S*6/Yr10’、‘Avocet S*6/Yr18’以及攜帶1BL/1RS易位片段的‘Avocet S*6/Yr9’近等基因系，陰性對照材料為‘Avocet S’、‘銘賢169’。其中Avocet S系列由澳大利亞悉尼大學植物育種所培育，所有小麥品種均由中國農業科學院植物保護研究所麥類病害組收集、繁存。

1.2 引物序列的合成

Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的STS或SCAR分子標記引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Primersequences

檢測目標Target引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)退火溫度/℃Annealingtemperature參考文獻Reference1BL/1RSAF1AF4GGAGACATCATGAAACATTTGCTGTTGTTGGGCAGAAAG60Francisetal[19]Yr10SC200FSC200RCTGCAGAGTGACATCATACATCGAACTAGTAGATGCTGGC60Shaoetal[12]Yr18sclv34Fsclv34RGTTGGTTAAGACTGGTGATGGTGCTTGCTATTGCTGAATAGT60Lagudahetal[14]

1.3 基因組DNA的提取

采用CTAB方法[20-22]提取小麥葉片DNA，使用Nano Drop(ND-1000)測定DNA濃度，并稀釋至終濃度30 ng/μL。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

PCR反應體系為10 μL，包含6 μL 2×TaqPlus PCR Master Mix，每條引物(5 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(30 ng/μL)90 ng。其中Yr10的反應程序[21]為：94 ℃變性3 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。Yr18的反應程序為：95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。1BL/1RS的反應程序為：94 ℃變性3 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后在UVI pro紫外凝膠成像系統上觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 Yr10和Yr18的分子檢測及其分析

邵映田等[12]研究表明，Yr10的引物SC200在含Yr10的品種上能檢測出200 bp和180 bp兩條帶，不含Yr10的品種只能檢測出180 bp一條帶。本試驗應用SCAR標記對部分供試材料進行PCR擴增(圖1)，結果發現，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr10’上能檢測出200 bp和180 bp兩條帶，感病品種‘銘賢169’只能檢測出180 bp一條帶。75份材料中，‘新麥26’、‘蘇育麥1號’等13份品種能夠檢測出200 bp和180 bp兩條帶，推測這些品種含有Yr10基因，約占檢測樣本的16.0%。其余57份材料均檢測到非抗性標記帶，推測這些品種不含Yr10基因。其中，‘周麥22’的檢測結果與董淑靜等[23]檢測結果一致。所有供試材料Yr10基因的分子檢測結果見表2。

圖1 部分供試小麥品種的Yr10 SCAR標記擴增結果Fig.1 PCR detection of Yr10 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

Kolmer[15]等研究表明，利用引物sclv34對小麥抗條銹病基因Yr18進行分子檢測，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr18’上能擴增出150 bp的特征條帶，感病品種‘Avocet S’能擴增出229 bp的片段。本試驗應用引物sclv34對供試材料進行PCR擴增(圖2)，在陰性對照‘銘賢169’上不能擴出任何片段，在陽性對照品種‘Avocet S*6/Yr18’和陰性對照‘Avocet S’的擴增條帶與上述研究一致。在全部待測品種中，僅有‘西農928’擴出擴增出150 bp的片段，推測‘西農928’含有Yr18，占檢測品種的1.3%；其余74份材料未擴增出特征條帶，推測這些品種中均不含有Yr18基因。

圖2 部分供試小麥品種的Yr18 SCAR標記擴增結果Fig.2 PCR detection of Yr18 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

2.2 1BL/1RS易位的分子檢測及其分析

根據之前的研究結果[9，19]，1BL/1RS易位的SCAR引物AF1/AF4能擴增出1.5 kb的抗性標記帶。圖3可以看出，陽性對照‘Avocet S*6/Yr9’能擴出1.5 kb的條帶，陰性對照‘Avocet S’不能擴出此條帶。75份材料中，‘石麥15號’、‘京冬17’等24份材料能擴出1.5 kb的特征帶，推測這些小麥品種含有1BL/1RS易位片段，約占檢測樣本的33.3%。所有供試材料1BL/1RS易位片段的分子檢測結果見表2。

系譜分析得知，‘京花9號’、‘石麥19’、‘京冬17’、‘京冬18’均為‘洛夫林10’的后代，它們的1BL/1RS易位可能來自‘洛夫林10’；‘邢麥6號’和‘邯麥13號’的1BL/1RS易位來自‘山前麥’；‘山農優麥2號’的親本含有‘牛朱特’，它的1BL/1RS易位可能來自‘牛朱特’。

圖3 部分供試小麥品種1BL/1RS易位的STS標記擴增結果Fig.3 PCR detection of 1BL/1RS translocation by STS in partial tested wheat cultivars

表2 75份小麥品種的Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測1)Table 2 Molecular detection results of Yr10 and Yr18 and 1BL/1RS translocation in 75 wheat cultivars

續表2Table2(Continued)

編號No．品種Cultivar品種來源Cultivarorigin選育省市Place檢測結果Detectionresults1BL/1RSYr10Yr1837淮麥29淮麥20/綿陽04254江蘇+--38浚麥99?798264/豫麥52河南鶴壁-+-39鄭育麥9987豫麥21/豫麥2號∥豫麥57河南鄭州+--40輪選988矮敗小麥輪回選擇群體河南新鄉---41新麥21偃展1號/新麥9號河南新鄉---42山農17L156/萊州137山東泰安---43冀5265冀5006/9204河北+--44邯麥13號山農太91136/冀麥36河北邯鄲+--45石麥19號石4185∥(煙輻188/臨8014)F2河北石家+--46河農6049石6021/河農91459河北+--47洛旱11豫麥25號/山農45河南洛陽+--48山農優麥2號PH85?115?2∥79401/魯麥11號山東++-49洛旱9號豫麥49/山農45河南洛陽+--50洛旱13洛旱2號/晉麥47河南洛陽---51河農825臨遠95?3019/石4185河北+--52綿麥3671275?1/99?1522四川---53揚麥20揚麥10號/揚麥9號江蘇---54南農0686MV964091/寧麥9號江蘇---55山農19(83(3)?113/1604)F3∥886059山東-+-56山農20PH82?2?2/954072山東---57新麥26新麥9408/濟南17河南新鄉-+-58蘇育麥1號煙1668/魯麥21號江蘇連云港-+-59鄭麥9962豫麥18/Ta971832河南+--60魯墾麥9號徐9935/煙優361山東---61郯麥98濟寧13/942山東---62運旱618運旱92?18/新春9號山西---63滄麥6005臨汾6154/321?4?6河北滄州---64保麥10號石4185/96Y6河北保定---65京冬18F404/(長豐1/ore∥雙82?4/81?142)∥931北京+--66中麥415貴農11/京411∥京411北京---67克旱20克89?46/Cundo黑龍江---68遼春18號遼春10號變異株系選遼寧---69遼春20號鐵春2號/8452遼寧-+-70航麥96號遼春10號變異株系選遼寧-+-71巴豐5號永1087∥Y2008?6/巴麥10號內蒙古+--72晉春15號YecorarF70/晉春9號山西---73隴春27號8858?2/隴春8號甘肅+--74高原412高原602/181∥臨汾5309青海-+-75赤麥7號B37/94?5內蒙古赤峰-+-

1) + 表示存在；-表示不存在。 + Indicate presence，-indicate absence.

3 討論與結論

3.1 分子檢測的有效性及準確性分析

近年來，DNA分子標記技術操作方便，且檢測不受季節和環境條件的影響，因而在小麥抗條銹遺傳研究中發掘基因緊密連鎖的DNA標記，并通過標記輔助選擇育成了一批有價值的種質。試驗中采用的分子標記SC200與Yr10緊密連鎖，與Yr10遺傳距離為0.5 cM[12]；引物sclv34為Yr18的共顯性標記，與Yr18遺傳距離為2.5 cM[15]，兩個分子標記與基因間的遺傳距離均小于3 cM，因此檢測結果有重要參考價值。在75個品種的分子檢測中，只有‘西農928’同時檢測到Yr10、Yr18基因的標記位點，建議加快推廣利用。1BL/1RS易位系是由黑麥染色體1R的短臂上通過染色體易位轉入普通小麥1B染色體上形成的，而本試驗選用了Francis[18]等研究的黑麥染色體臂1BL/1RS易位的引物AF1/AF4為探針，提高了分子檢測的準確度。

3.2 各地待測品種中基因Yr10、Yr18的利用情況

Yr10對我國目前流行的條銹菌小種具有良好的抗性，王鳳樂等[24]對我國綿陽系小麥抗條銹病調查表明，Yr10對中國近年來的優勢生理小種條中30和條中31號表現免疫，井長勤等[25]對我國重要小麥品種抗條銹基因的分析中未能找到含有Yr10品種。從本試驗檢測結果可以看出，我國國審小麥品種中含Yr10的品種占檢測品種的17.3%，主要分布在河南，有4個小麥品種，分別是‘周麥22號’、‘周麥23號’、‘浚麥99-7’、‘新麥26’，占所有Yr10品種的20.1%；其次是山東和遼寧，均占有10.5%，分別是‘山農優麥2號’、‘山農19’和‘遼春20號’、‘航麥96號’；再者，陜西的‘西農928’，青海的‘高原412’，內蒙古的‘赤麥7號’，安徽的‘皖麥52號’，江蘇的‘蘇育麥1號’均檢測出含有Yr10基因。總體看來，Yr10基因在目前中國的國審小麥品種中很少被利用，有的小麥生產大省如來自河北的選育品種中未檢測到Yr10，因此，為更好地防治小麥條銹病，應加強抗銹性表現良好的抗性基因Yr10在小麥育種上的利用。

李在峰等[26]研究發現成株抗性基因Yr18在生產上應用可減少條銹病毒性生理小種的危害。楊文雄等[7]對我國234份育成品種檢測中僅有14份材料攜帶Yr18。本試驗中75個待測品種中僅有一個品種即陜西的‘西農928’檢測出Yr18。說明在我國小麥育種中，基因Yr18的利用率比較低，因此，在以后的育種中，可以利用分子標記進行輔助育種，加大對基因Yr18等慢銹基因的有效利用，提高品種的抗性水平。

3.3 1BL/1RS品種的分布情況及其原因

從抗性基因在生產品種中出現的頻率看，在當前生產上的小麥品種中所具有的抗條銹基因以Yr9所占比例最大，這與中國小麥品種1BL/1RS易位系的利用有關[27]。70年代初，我國從羅馬尼亞引入了一些含有1BL/1RS易位系小麥品種如‘洛夫林10號’、‘洛夫林13’、‘洛夫林18’、‘山前麥’、‘高加索’、‘阿芙樂爾’等作為我國小麥育種的骨干親本[28]。本試驗中1BL/1RS易位系占有33.3%，主要分布在河北，包括‘石麥15號’、‘邢麥6號’、‘金禾9123’、‘冀5265’等8個品種，占所有1BL/1RS品種的32%，河南占有28%，包括‘金麥8號’、‘漯麥9號’、‘洛旱11’、‘許科1號’等7個品種；其次是北京占有16%，江蘇占有12%，它們分別是‘京冬17’、‘京冬22’、‘京花9號’、‘京冬18’和‘淮麥21’、‘淮麥28’、‘淮麥29’；另外，山東的‘山農優麥2號’，內蒙古的‘巴豐5號’，甘肅的‘隴春27號’也檢測出有1BL/1RS易位。隨著1BL/1RS品種被大量利用，其品種已逐漸對新的生理小種喪失了抗性，并且1BL/1RS小麥品種加工的面團耐揉性弱、面團發黏，面團品質變劣[29]。因此1BL/1RS品種在育種選擇親本時謹慎使用。

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MoleculardetectionofYr10andYr18genesand1BL/1RStranslocationinwheatcultivars

Zhang Yuwei1,2,Liu Bo2,Liu Taiguo2,Gao Li2,Chen Wanquan2

(1.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Using SCAR or STS molecular markers, 75 Chinese commercial wheat cultivars were detected for the existence of stripe rust-resistant genesYr10 andYr18 and 1BL/1RS translocation from 2006 to 2010.The results showed that there were 13 cultivars containingYr10 gene, accounting for 17.3% of the total tested cultivars, only 1 cultivars withYr18, accounting for 1.3%, and 25 cultivars with 1BL/1RS translocation, accounting for 33.3%.Wheat cultivar ‘Xinong 928’ was found to contain bothYr10 andYr18.1BL/1RS translocation, which is resistant to most popular stripe rust races, has been widely used in wheat breeding programs.The slow rust resistance geneYr18 was seldom used in wheat breeding.Therefore, we suggest that the application ofYr18 gene be increased.

wheat; molecular marker; stripe rust resistance gene; 1BL/1RS translocation

2013-04-23

： 2013-05-18

國家科技支撐計劃課題(2012BAD19B04);國家“973”計劃(2013CB127704);公益性行業(農業)科研專項(200903035);現代農業產業技術體系(CARS-03)；國家自然科學基金項目(31371884)

S 435.121.42

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.009

* 通信作者 E-mail:tgliu@ippcaas.cn；wqchen@ippcaas.cn