番茄斑萎病毒YN-1株系GN/GC基因的克隆與分析

孫書娥，李 萌，朱春暉，譚新球，劉 勇,，張德詠,*

(1.湖南農業大學植保學院，長沙 410128；2.湖南省農業科學院植物保護研究所，長沙 410125；3.園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室，長沙 410125)

番茄斑萎病毒YN-1株系GN/GC基因的克隆與分析

孫書娥1，李 萌2,3，朱春暉2,3，譚新球2,3，劉 勇1,2,3，張德詠1,2,3*

(1.湖南農業大學植保學院，長沙 410128；2.湖南省農業科學院植物保護研究所，長沙 410125；3.園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室，長沙 410125)

作者以TSWV YN-1株系為研究材料，克隆了其GN/GC基因，測序后與GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因進行比對，結果顯示：YN-1 GN/GC基因全長3 408 bp，編碼1 135個氨基酸，構建的系統發育樹可分為4個群，YN-1屬于群Ⅱ，與源自西班牙的SPAIN-2株系的GN/GC基因核苷酸相似性最高，達98.88%，氨基酸相似性達98.85%。YN-1株系N基因和GN/GC基因的起源不同，我們推斷YN-1可能是一個發生重排(reassortment)的新株系，是不同地理起源的株系在共同傳播過程中發生了重排的結果，具體原因有待進一步研究。

番茄斑萎病毒; GN/GC基因; 克隆; 分析

番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)的一個典型成員，廣泛分布于世界各地[1]，可侵染100多科1 100多種單、雙子葉植物，尤其是茄科植物，引起嚴重的經濟損失。其基因組為負單鏈病毒，包含3個片段，從大到小分別被稱為L RNA、M RNA 和S RNA。其中L RNA編碼依賴于RNA的RNA復制酶(RdRp)，M RNA為雙義RNA，編碼運動蛋白(NSm)和高度保守的GN/GC基因。同為雙義RNA的S RNA編碼核衣殼蛋白(nucleoprotein)和非結構蛋白(NSs)。據報道，GN/GC基因與病毒裝配和薊馬傳播病毒特性相關[2]。編碼核衣殼蛋白的N基因高度保守，常被作為判斷株系和血清學反應類型的重要因素[3]。2010年，筆者從云南分離了TSWV YN-1株系，并克隆了N基因(GenBank登錄號為：HM694685)，對其進行了序列相似性分析[4]。近年來，TSWV的傳播介體——西花薊馬[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]在我國北京、四川、河北、浙江、云南、貴州及山東等地迅速擴散[5-7]，暴發成災。為了解TSWV的發生流行與西花薊馬傳播的關系，本文克隆了YN-1株系的GN/GC基因，分析了其與GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因的同源性關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

YN-1是作者于2009年從云南番茄上分離鑒定的株系[4]，在矮牽牛上分離，三生煙上繁殖保存。實驗室所用Taq酶、反轉錄酶、PCR純化回收試劑盒均購自TransGen Biotech公司，pGEM-T easy Vector購自Promega公司，PCR引物由上海生工公司合成，氨芐青霉素購自上海生工公司。其他化學試劑均為國產分析純試劑。大腸桿菌(E.coli)JM109菌株、矮牽牛、三生煙均由湖南省植物保護研究所分子生物學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 番茄斑萎病毒的接種與繁殖

TSWV的接種與繁殖參照文獻[4]方法進行，在三生煙上繁殖備用。

1.2.2 植物總RNA的提取

采用改進的硅粒吸附法提取葉片總RNA[8]。

1.2.3 cDNA的合成

以提取的RNA為模板用于cDNA的合成，使用TransGen Biotech公司反轉錄試劑盒。依次加入RNA 5 μL，Random Primer(N9，0.1 μg/μL)1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，加入RNase-free Water 至20 μL；輕輕混勻，25 ℃孵育30 min，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃加熱5 min失活TransScript RT/RI Enzyme Mix。即得cDNA。

1.2.4 RCR檢測

通過比較GenBank中TSWV GN/GC基因的保守序列，設計用于擴增TSWV GN/GC全長序列的引物(表1)。每對引物擴增的片段與鄰近片段均重疊100 bp左右。

表1PCR引物序列

Table1ThesequencesofPCRprimers

引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)位置Locationinthecompletesequence退火溫度/℃Annealingtemperature擴增片段長度/bpExpectedsizeofPCRproductFG1RG1ATGAGAATTTTAAAACTACTAGAACTAGTGATCGGATAGGGAAATAGATCAACAAAG1～301008～982 521008FG2RG2GAGTTAGAGATTGCATAATCAAATATTCGTCCCTCCTCCTCCTAAAAGAGATTGTTC892～9191927～1898601036FG3RG3CTGGAATGATTGCAGGAGATTCTCCCTTGACCGCATAGAAGACAGCCG1780～18032821～2791601042FG4RG4GATCTGGTTTAGAGCAAATATCAGTCAGACAAGGTGAGAGAAATCCATAG2623～26463408～338250 786

取一0.2 mL PCR薄壁管，依次加入以下試劑：0.25 μL 10×反應緩沖液，0.5 μL 10 mmol/L的dNTP混合物，1 μL 20 μmol/L上游引物，1 μL 20 μmol/L下游引物，1 μL cDNA模板，0.3 μL 5 U/μL的TaqDNA聚合酶，加滅菌ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性50 s，退火溫度(因引物的Tm值不同而不同)由G1至G4分別為55.4 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、50.2 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。反應完畢后，從反應液中取5 μL，電泳檢查擴增結果。

1.2.5 目的片段的回收

經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物正確后，用TransGen Biotech公司PCR割膠純化回收試劑盒回收目的片段。

1.2.6 PCR產物的克隆

回收后的PCR片段與pGEM-T easy Vector 載體經4 ℃過夜連接后，連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)JM109感受態細胞。37 ℃過夜培養14～16 h后，挑取單菌落進行PCR菌落篩選，選取陽性單菌落在含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中37 ℃，200 r/min的條件下進行培養，對培養菌液提取質粒后，經PCR和酶切鑒定篩選重組質粒。將含目的片段的重組質粒送上海生工公司測序。

1.2.7 序列分析

通過測序所得到的序列經NCBI數據庫載體識別程序(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)去除載體進而得到目的序列，使用DNAStar(Version 5.01)對目的序列進行拼接及格式轉換，本文用來構建系統發育樹的其他已知株系的GN/GC基因信息均來自GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)(見表2)，利用MEGA 5進行序列分析。在序列比對過程中，首先用Clustal X進行序列比對分析，然后采用最小進化法的鄰接法(neighbour-joining method)構建系統發育樹，Bootstrap選擇1 000次重復，一般Bootstrap值<70的分支常被認為是不可靠的[9-11]。由于番茄褪綠斑病毒(Tomatochloroticspotvirus，TCSV)在Tospovirus內與TSWV同源關系最接近[12]，所以選用TCSV(GenBank登錄號：AY574054)作為本研究構建系統發育樹的外群。

表2本文所用TSWV株系的基本信息1)

Table2TheinformationofTSWVisolatesusedinthisstudy

登錄號Accessionnumber株系Strain寄主Host地理起源GeographicoriginAB190818///AF208498Regular2A/美國AY744481CA?3菊花美國AY744486NC?3大麗花美國AY744487NC?4煙草美國AY744489NC?6辣椒美國AY744492SPAIN?1番茄西班牙AY744493SPAIN?2番茄西班牙AY744494NC?9辣椒美國AY870389T紫背草美國AY870390M紫背草美國FM163370GRAU番茄西班牙FM163372ZO番茄西班牙HM015510Ab1NL2番茄西班牙HM015516D?191/澳大利亞HM015521Sala1TL3番茄西班牙HM015522ViTL3番茄西班牙HM581935TomatoNJ?JN番茄韓國HM581938Pepper1CY?CN辣椒韓國HQ830188p2023WT辣椒意大利JF960236TSWV?YN番茄中國JN664253CG?1萵苣中國KC261951TSWV?5牛繁縷韓國KC261960TSWV?8山萵苣韓國KC261966TSWV?12萵苣韓國KC261969TSWV?16番茄韓國KC261975TSWV?18菊花韓國KC294568YN?1番茄中國NC002050///AY574054//巴西

1) /：信息不存在Information not available.

2 結果與分析

2.1 RT-PCR結果

采用RT-PCR的方法，設計擴增GN/GC基因的引物，擴增TSWV YN-1株系的GN/GC基因，得到的擴增產物分別為1 008、1 036、1 042和786 bp左右，與預期目的片段大小一致(圖1)。

圖1 TSWV YN-1 G1、G2、G3和G4的PCR擴增產物Fig.1 The PCR products of TSWV YN-1 G1, G2, G3 and G4

2.2 GN/GC基因的克隆和鑒定

將擴增得到的G1、G2、G3和G4的PCR片段經瓊脂糖凝膠電泳割膠回收后，連接至Promega公司pGEM-T easy Vector 上，轉化至E.coliJM109感受態細胞中，挑取單菌落進行菌落PCR篩選，通過PCR篩選，獲得與預期大小一致的目的條帶，所提陽性菌液質粒進行酶切后，也同樣得到了與預期大小一致的片段(圖2)，所提質粒送北京華大六合基因公司進行測序，測序結果經SeqMan分析后，結果表明TSWV YN-1 GN/GC基因的大小為3 408 bp，GenBank 登錄號為KC294568。

2.3 序列同源性分析

所得序列通過與GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因比對(圖3)，結果顯示：TSWV YN-1 GN/GC基因(KC294568)與GenBank中報道的其他株系(表2)GN/GC基因的核苷酸一致率為97.36%，氨基酸一致率為97.95%，建立的系統發育樹可分為4個群，在群I的11個成員中，病原分離物來自煙草、辣椒、番茄、菊花和紫背草等寄主植物，寄主的地理起源大多數為美國，僅有2個源自韓國，1個源自西班牙；在群Ⅱ的10個成員中，病原物寄主主要是番茄，1個是牛繁縷，1個是山萵苣，寄主的地理起源多為西班牙，4個源自韓國，僅有1個源自中國即為TSWV YN-1株系，其GN/GC基因(GenBank登錄號：KC294568)的同源性與源自西班牙的SPAIN-2株系(GenBank登錄號：AY744493)的同源性最高, 核苷酸相似性達98.88%，氨基酸相似性達98.85%；群Ⅲ中僅有2個成員均源自中國，寄主植物分別為萵苣和番茄；在群Ⅳ的6個成員中，寄主和寄主起源各不相同，寄主植物包括萵苣、番茄、辣椒和大麗花等，地理起源有澳大利亞、韓國、西班牙、意大利和美國等。

圖2 TSWV YN-1 G1-T、G2-T、G3-T和G4-T質粒酶切產物電泳圖Fig.2 The digested products of G1-T, G2-T, G3-T and G4-T of TSWV YN-1

圖3 TSWV YN-1(KC294568)與其他株系的GN/GC基因核苷酸系統發育樹Fig.3 Phylogenetic relationship between TSWV YN-1 (KC294568) and other isolates based on the GN/GC gene

3 討論

番茄斑萎病毒由西花薊馬以持久性傳播的方式進行自然傳播。由于西花薊馬擴散快，寄主范圍廣，又是TSWV主要的傳毒介體，因此西花薊馬的擴散傳播導致了部分地區作物上TSWV的暴發流行。在介體傳播TSWV過程中，TSWV GN/GC基因編碼的糖蛋白起到了至關重要的作用。當病毒粒子通過前腸進入中腸后，中腸上皮細胞膜的一種受體蛋白與TSWV表面的糖蛋白結合，然后進入介體細胞內，再通過一系列的膜屏障進入介體唾液腺[2,13]，最后攜帶病毒的介體通過取食新的寄主植物從而引起TSWV的傳播。本文克隆了TSWV YN-1的GN/GC基因，比較了其與GenBank中30個源自美國、韓國、西班牙等國的代表性株系的親緣關系，結果表明其與源自西班牙、韓國的株系親緣關系最近，同屬群Ⅱ。因此，YN-1有可能是從西班牙、韓國等地入侵我國的帶毒西花薊馬侵染作物后形成的新株系。

我們選擇了目前GenBank中TSWV的代表性株系，包括源自美國、韓國等地的30個株系，構建了系統發育樹，其可分為4個群。TSWV YN-1 GN/GC基因與源自西班牙的SPAIN-2株系(GenBank登錄號：AY744493)的同源性較高，位于群Ⅱ中。2010年，我們克隆了TSWV YN-1 N基因的全長序列并進行了同源性分析，發現YN-1 N基因與韓國3個株系的同源性較高[3]。YN-1株系N基因和GN/GC基因同源性分析屬于不同的群，說明它們的起源不同，我們推斷YN-1可能是一個重排(reassortment)的新株系，是不同地理起源的株系在共同傳播過程中發生了重排的結果，具體原因有待進一步研究。

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CloningandsequenceanalysisoftheGN/GCgeneofTomatospottedwiltvirusYN-1

Sun Shue1,Li Meng2,3,Zhu Chunhui2,3,Tan Xinqiu2,3,Liu Yong1,2,3,Zhang Deyong1,2,3

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.InstituteofPlantProtection,HunanAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410125,China; 3.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofthePestsandDiseasesonHorticulturalCropsinHunanProvince,Changsha410125,China)

In this study, we cloned the complete nucleotide sequence of GN/GCgene of TSWV YN-1 strain, and analyzed its phylogenetic relationship to other TSWV isolates from GenBank.The results showed that the complete nucleotide sequence of GN/GCgene was 3 408 nt and encoded 1 135 aa, and the phylogenetic tree of the complete nucleotide sequence of the GN/GCgene of TSWV isolated from different hosts in different geographic origins in the world, divided into four groups, were constructed, where TSWV YN-1 was in group Ⅱ, and the complete nucleotide and amino acid sequences of GN/GCexhibited 98.88% and 98.85% identity with SPAIN-2 (accession number: AY744493) isolated from tomato in Spain, respectively.Because the origins of N gene and GN/GCgene of TSWV YN-1 were different, we inferred that TSWV YN-1 might be a new strain, resulted from a reassortment event happened in co-transmission between different strains of geographic origins.The mechanism needs to be studied further.

Tomatospottedwiltvirus; GN/GCgene; clone; analysis

2013-08-29

： 2013-10-11

國家自然科學基金(31171816，30871619);國家公益性行業(農業)科研專項(201303028);湖南省應用基礎研究計劃重點項目(2012FJ2009)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.011

* 通信作者