黑尾葉蟬精氨酸激酶和一個谷胱甘肽-S-轉移酶基因的克隆和發育表達特性研究

侯吉祥，孟盼盼，馬偉華，周 菲，林擁軍

(華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室， 武漢 430070)

黑尾葉蟬精氨酸激酶和一個谷胱甘肽-S-轉移酶基因的克隆和發育表達特性研究

侯吉祥，孟盼盼，馬偉華，周 菲，林擁軍*

(華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室， 武漢 430070)

黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)是一種能傳播病毒的水稻害蟲，對水稻生產有著巨大的威脅。本文在黑尾葉蟬中克隆得到了一個精氨酸激酶基因(NcAK)和一個delta類型的谷胱甘肽-S-轉移酶基因(NcGST)，并對兩個基因進行了序列分析和表達特性檢測。結果表明，NcAK包含的開放閱讀框長度為1 068 bp，編碼一個含356個氨基酸的蛋白。進化研究表明該蛋白序列與玻璃翅葉蟬(Homalodiscavitripennis)的精氨酸激酶的序列親緣關系最近。Real-time結果表明NcAK在黑尾葉蟬的雄成蟲中表達量高于在卵、1齡若蟲、5齡若蟲和雌成蟲中的表達量。NcGST的開放閱讀框由651個堿基組成，編碼一個包含217氨基酸的蛋白，進化研究表明該蛋白與美國牧草盲蝽(Lyguslineolaris)GSTs編碼蛋白親緣關系最近。表達量檢測表明NcGST在5齡若蟲和雌雄成蟲中的表達量要高于在卵和1齡的表達量。

黑尾葉蟬； 精氨酸激酶； 谷胱甘肽-S-轉移酶

黑尾葉蟬[Nephotettixcincticeps(Uhler)]是一種主要分布在長江中上游和西南各省的水稻害蟲，它不僅通過吸取水稻汁液為害水稻，同時能夠傳播水稻黃矮病、水稻矮縮病等水稻病毒病，一旦病害暴發將對水稻產量造成極大的影響[1]。目前對黑尾葉蟬主要采用農藥防治。但是由于農藥的過量使用，黑尾葉蟬已經對有機磷類和有機氯類農藥產生了一定的抗藥性，需要尋找發展更安全高效的抗蟲方法。

精氨酸激酶是僅存于無脊椎動物體內的磷酸原激酶，主要功能是通過催化精氨酸和ATP之間的可逆反應將能量存儲于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，磷酸精氨酸是昆蟲肌肉中唯一有效形成ATP的磷酞基供體[2]。不僅如此，精氨酸激酶在甲殼動物的免疫中也起著一定的作用[3]。目前已經在多個物種中都得到了精氨酸激酶的cDNA序列[4-5]。

谷胱甘肽-S-轉移酶Glutathione-S-transferase (GSTs)是多個基因編碼、具有多種功能的超基因家族酶，分子量23～29 ku。根據亞細胞定位，谷胱甘肽-S-轉移酶可以分為微粒體型(microsomal GSTs)、線粒體型(mitochondrial GSTs)和胞質型(cytosolic GSTs)三大類型。其中胞質谷胱甘肽-S-轉移酶是研究最多的類型，通常所指的谷胱甘肽-S-轉移酶即為此類。昆蟲胞質谷胱甘肽-S-轉移酶包括omega、sigma、theta、zeta、delta和epsilon 6個已知的家族[6]。其中delta家族和epsilon家族是昆蟲生物體特有的家族。谷胱甘肽-S-轉移酶對昆蟲的對農藥的敏感性降低有著重要的意義。研究表明，谷胱甘肽-S-轉移酶在有機磷殺蟲劑尤其是二甲基膦酸酯和二甲基硫代膦酸酯的代謝中起著相當重要的作用，對保棉磷、碘甲烷、3,4-二氯硝基苯也都表現出很高的代謝活性[7]。在對有機磷農藥有抗性的德國小蠊(BlattellagermanicaLinnaeus)的研究中，吳剛等證明抗性品系德國小蠊的谷胱甘肽-S-轉移酶酶活力相對于敏感品系明顯提高[8]。Zhu等發現GSTs抑制劑能夠降低美國牧草盲蝽對農藥原料1-氯-2,4-二硝基苯和馬拉硫磷的抗性[9]，提高農藥對盲蝽的致死率。目前已經有研究表明黑尾葉蟬對敵敵畏等有機磷農藥具有很高的抗藥性[10]，而GSTs對于有機磷類和有機氯農藥在昆蟲體內的代謝中起著很重要的作用，因此研究黑尾葉蟬的GSTs對研究黑尾葉蟬的解毒能力有著重要的意義。本文克隆了一個編碼黑尾葉蟬的精氨酸激酶的NcAK基因和一個編碼黑尾葉蟬谷胱甘肽轉移酶的NcGST基因的CDS序列，對序列進行了保守結構域預測和系統進化樹分析, 并檢測它們mRNA的表達特性，為以后深入研究精氨酸激酶和谷胱甘肽轉移酶在黑尾葉蟬體內的表達調控及谷胱甘肽轉移酶的解毒機制打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黑尾葉蟬于2009年8月采集于江西南昌，然后于本實驗室內用水稻感蟲品種‘TN1’保存。培養條件為：溫度(26±2)℃，相對濕度50%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 材料

限制性內切酶、Taq酶、TA克隆試劑盒、Trizol試劑、DEPC為上海生工產品；反轉錄試劑盒購自Roche公司；特異引物由武漢安基生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

取黑尾葉蟬在液氮中研磨成粉末，用Trizol 試劑盒提取總RNA，用DNA酶消化痕量DNA，按反轉錄試劑盒說明合成第一鏈cDNA。

1.3.2 基因的擴增

設計NcAK和NcGST的擴增引物見表1，以黑尾葉蟬的cDNA為模板，進行擴增，擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，32 個循環；終延伸72 ℃ 7 min。

表1NcAK和NcGST的擴增引物序列

Table1TheprimersofNcAKandNcGST

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′→3′)NcAKFCTCCTAGCGTCACTCCGTTCNcAKRTGAAAATAGGAGCCGCCGTGNcGSTFCTGATGCGTAGTGAGGTGTGANcGSTRTGCAGTCACTTCGGTTGTGT

1.3.3 基因的克隆與測序

取4μL 的PCR產物，用p-EASY T3 clone kit進行TA克??；從藍白斑平板中挑取單個白色菌落擴大培養，重組質粒用EcoR I 酶切鑒定，選擇其中4個陽性克隆，用引物SP6/T7測序。

1.3.4 序列分析、同源性分析和進化樹的構建

利用DNAman軟件對兩個基因進行翻譯，利用軟件DNAman對蛋白質等電點和分子量進行預測。利用NCBI在線工具Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)對兩個基因進行保守結構域的搜索。利用NCBI在線工具Blastx對兩個基因進行同源基因的尋找。采用Mega5.0軟件的鄰接法(NJneighbor-joining)構建進化距離分析的P-distance模型，系統樹每個分支的統計學顯著性分析以bootstrap 進行檢驗，重復次數為1 000 次。

1.4 NcAK和NcGST的表達特性研究

分別提取不同發育階段和性別黑尾葉蟬(24 h內產下的蟲卵、24 h內蛻皮的1齡若蟲、5齡若蟲和雌雄成蟲)的總RNA，取2 μg 總RNA 反轉錄成cDNA 模板，再設計引物(表2)，檢測基因表達量。使用TaKaRa公司的real-time試劑盒20 μL體系。擴增條件：95 ℃預變性30 s；然后95 ℃ 35 s，60 ℃36 s。共40個循環；利用Excel軟件使用 2-△△Ct法將獲得的數據進行方差分析，利用SPSS軟件中Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性分析。

表2NcAK和NcGST的RT引物序列

Table2TheprimersforRT-PCRofNcAKandNcGST

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′→3′)NcAKRTFTCATTAAGATTGAGCGAGAANcAKRTRTGTAGTCGGTTCTGTCTTNcGSTRTFTTCTTCTTCTTCTCTTCATCNcGSTRTRAACCAGAGGCTATACTTC

2 結果與分析

2.1 NcAK和NcGST序列分析

擴增得到兩條長度分別為799 bp和1 144 bp的cDNA片段,NcAK基因的開放閱讀框由1 068個堿基組成，編碼356個氨基酸，分子量為 40 134.59，推測蛋白序列等電點為5.98。NcGST的開放閱讀框由651個堿基組成，編碼217個氨基酸，推測蛋白序列分子量為24 168.7，等電點為6.74。其核酸序列及按三聯密碼子推導出的氨基酸序列見圖1和圖2。用NCBI在線工具 Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)預測發現NcAK具有精氨酸激酶的保守結構域，NcGST具有delta和epsilon類型的GSTs保守結構域。BlastX比對分析顯示，NcAK基因推測編碼蛋白與其他物種的精氨酸激酶蛋白序列相似性高達90%～97%，而NcGST基因推測編碼蛋白與其他物種GSTs基因蛋白序列相似性達到60%～74%，其中與delta類型的GSTs基因相似程度最高。因此推測，NcAK基因編碼精氨酸激酶而NcGST基因編碼一個delta類型的谷胱甘肽轉移酶。

圖1 NcAK的開放閱讀框推測得到的蛋白序列Fig.1 The ORF and the deduced protein of NcAK

圖2 黑尾葉蟬谷胱甘肽-S-轉移酶NcGST的開放閱讀框和推測得到蛋白序列Fig.2 The ORF and the deduced protein of NcGST

2.2 序列的同源性分析和進化樹構建

為了解NcAK和NcGST與其他物種精氨酸激酶和GSTs的親緣關系，利用Mega5.0軟件NcAK和NcGST預測的蛋白序列與其他物種同源蛋白序列進行進化分析。結果(圖3和圖4)顯示，在選取的昆蟲物種中NcAK與玻璃翅葉蟬(Homalodiscavitripennis)的精氨酸激酶和葉蟬(OncometopianigricansWalker)的精氨酸激酶同緣關系最近。而NcGST與半翅目的美國牧草盲蝽(LyguslineolarisGoeze)、半翅目的白背飛虱(SogatellafurciferaHorváth)和褐飛虱(NilaparvatalugensSt?l)的GSTs親緣關系最近。

2.3 基因表達特性研究

以核蛋白L19為內參，檢測了NcAK和NcGST在黑尾葉蟬24 h內產的卵，24 h內蛻皮產生的1齡和5齡若蟲以及雌雄成蟲中的表達情況，結果發現NcAK基因在黑尾葉蟬的幾個齡期中都有表達，在雄成蟲的表達量最高,差異性顯著(P<0.05)，在其他齡期表達量差異不大。而NcGST在5齡若蟲和雌雄成蟲中的表達量要高于在卵中和1齡若蟲中的表達量。

3 討論

本研究克隆得到了黑尾葉蟬精氨酸激酶的CDS序列,并進行了序列分析和表達特性研究。經過序列分析和同源性比對發現，NcAK推測得到的蛋白序列和其他昆蟲中得到的精氨酸激酶蛋白序列氨基酸一致性高達80% ～ 97%。這證明克隆得到的確實是精氨酸激酶，氨基酸相似性高度一致說明精氨酸激酶在進化中是高度保守的。這也證明了該基因的重要性。表達量檢測表明，該基因在黑尾葉蟬的不同齡期都有表達，在雄成蟲中表達量最高，和其余齡期差異顯著(P<0.05)，這也許與雄成蟲的發育特性有關。在其余的齡期中表達量差異不顯著。這表明NcAK的表達在成蟲中表現出了性別差異而沒有表現出不同齡期之間的差異。部分昆蟲如家蠶存在精氨酸表達量隨齡期的增加而增加的現象[4]，這也許與家蠶是完全變態昆蟲而黑尾葉蟬不是完全變態昆蟲有關。

人們已經以精氨酸激酶為靶標進行了大量抗蟲研究，徐秀鳳等利用飼喂以精氨酸激酶為靶標的dsRNA的方式提高了小菜蛾(PlutellaxylostellaLinnaeus)的死亡率[11]。蘇曉峰等發現利用RNAi的方法沉默精氨酸激酶基因可以有效延緩棉鈴蟲的生長發育[12]。而在黃曲條跳甲(PhyllotretastriolataFabricius)精氨酸激酶的研究中，Zhao通過RNAi方式沉默精氨酸激酶的表達，結果提高了黃曲條跳甲的死亡率，并降低了雌性黃曲條跳甲的產卵量[13]。這些試驗證明，以精氨酸激酶為靶標進行抗蟲是一種可行的方式。在黑尾葉蟬的抗蟲研究中，NcAK可以作為備選的抗蟲靶標。

圖3 精氨酸激酶蛋白質序列構建的進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of the deduced protein of NcAK and homologous gene sequences

本試驗分離得到了黑尾葉蟬谷胱甘肽-S-轉移酶基因NcGST的CDS序列，利用NCBI在線工具 Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)預測得到該基因編碼的蛋白擁有delta類型的NcGST的結構域，推測NcGST是delta類型的谷胱甘肽-S-轉移酶基因。預測的NcGST蛋白序列和美國牧草盲蝽內得到的谷胱甘肽-S-轉移酶的氨基酸有74%的相似性。美國牧草盲蝽內的GSTs具有解毒功能，由此推測NcGST也有類似功能。檢測表明NcGST在卵和1齡若蟲中表達量與在5齡若蟲和雌雄成蟲中表達量差異顯著(P<0.05)。由此可以推測，黑尾葉蟬對有機磷和有機氯類農藥的敏感性會隨著齡期的增加而降低，這在之前未見報道。而黑尾葉蟬對吡蟲啉、阿維菌素和噻嗪酮的敏感性變化中據報道有類似趨勢，林雪梅等發現，隨著齡期的增長，黑尾葉蟬對吡蟲啉、阿維菌素的敏感性會降低[14]，在其他昆蟲已經證明GSTs的活性與這兩種農藥在昆蟲體內的代謝有關[15-16]，所以這種現象也許與NcGST的表達量增加有關，推測NcGST對這類殺蟲劑也有解毒能力。黑尾葉蟬對噻嗪酮的敏感性同樣也隨著齡期的增加而降低，但是在褐飛虱抗性品系的研究中林友偉發現GSTs的活性與這種敏感性的降低無關[17]。黑尾葉蟬對噻嗪酮敏感性的降低可能有其他原因，需要進一步研究。

現在昆蟲對農藥的敏感性越來越低，發展安全高效的抗蟲策略已經迫在眉睫。本次研究中克隆到了黑尾葉蟬的精氨酸激酶和一個谷胱甘肽-S-轉移酶的CDS，分析了其序列特征和表達特征，為以后對黑尾葉蟬的研究提供了有用的信息，同時也為以后的抗蟲研究打下了基礎。

圖4 NcGST及其同源基因蛋白質序列構建的進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the deduced protein of NcGST and homologous gene sequences

圖5 NcAK在不同齡期的表達量Fig.5 The expression levels of NcAK during different stage

圖6 NcGST在不同齡期的表達量Fig.6 The expression levels of NcGST during different stage

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CloningandexpressionprofilesofargininekinaseandGSTsofNephotettixcincticeps

Hou Jixiang，Meng Panpan，Ma Weihua，Zhou Fei,Lin Yongjun

(NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovementinWuhan,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

The green leafhopperNephotettixcincticepsis a rice insect that can transmit plant viruses.We cloned and analyzed an arginine kinase gene namedNcAKand a delta class GSTs gene namedNcGSTinNephotettixcincticeps.NcAKcontained an open reading frame (ORF) of 1 068 bp in length, and encodes a protein of 356 amino acids.Phylogenetic analysis showed that the deduced protein ofNcAKwas closely related to the arginine kinase ofHomalodiscavitripennisandOncometopianigricans.The real-time PCR results indicated that theNcAKwas expressed higher in male adults than in the eggs, 1st instars, 5th instars, and female adults.NcGST, 899 bp in length, contained an ORF of 651 bp and encoded a protein of 217 amino acids.Phylogenetic analysis showed that the deduced protein ofNcGSTwas closely related to the GSTs ofLyguslineolaris.The real-time PCR results indicated thatNcGSTwas expressed higher in 5th instars, male adults and female adults than in eggs and 1st instars.

Nephotettixcincticeps; arginine kinase; glutathione-S-transferase

2013-05-17

： 2013-06-08

國家重大科技專項(2011ZX08001-001)

S 433.3

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.014

* 通信作者 E-mail:yongjunlin@mail.hzau.edu.cn