雞冠花褐斑病病原菌的生物學特性研究

劉起麗，張建新，田雪亮，郎劍鋒

(1.河南科技學院資源與環境學院，新鄉 453003；2.中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193；3.河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007)

雞冠花褐斑病病原菌的生物學特性研究

劉起麗1, 2，張建新3，田雪亮1，郎劍鋒1

(1.河南科技學院資源與環境學院，新鄉 453003；2.中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193；3.河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007)

雞冠花(CelosiacristataLinn.)是一種廣泛種植的觀賞和藥用花卉。雞冠花褐斑病是危害雞冠花生產的主要病害，本研究對分離自河南北部地區花圃的雞冠花褐斑病病原菌硫色鐮孢菌(Fusariumsulphureum)進行了鑒定和生物學特性研究。菌落在添加了雞冠花葉片汁液的燕麥粉瓊脂培養基上生長較好，生長最適溫度為25 ℃。病原菌分生孢子萌發最適溫度為20 ℃；酸性環境最有利于分生孢子萌發。分生孢子在5%蔗糖溶液中的萌發率與在5%葡萄糖溶液中相近且均高于清水和蒸餾水中的萌發率，光照條件對其萌發影響不大。

雞冠花褐斑病； 病原菌； 生物學特性

雞冠花(CelosiacristataLinn.)是莧科一年生草本植物，其莖葉、花序和種子均可藥用[1-2]，其干燥花序為止血止帶的中藥材，被《中國藥典》收錄[3]。雞冠花褐斑病(brown spot of cockscomb)是危害雞冠花的一種常見真菌病害，全國各地均有發生。近幾年在豫北地區溫室及花圃發生尤為普遍和嚴重。該病病原菌屬半知菌亞門硫色鐮孢菌(FusariumsulphureumSchltdl.)和雞冠花磚紅鐮孢菌(F.lateritiumf.sp.celosiaeTassi)，葉片初生淡黃褐色小點，后擴大成近圓形或橢圓形，直徑1～10 mm,邊緣暗褐色至紫褐色，略隆起，具模糊的同心輪紋，發展后期常造成葉片變褐枯黃、莖部腐爛倒伏、根部腐爛表面布滿白色細絲狀物，嚴重影響其藥用價值。本研究對豫北地區雞冠花褐斑病病原菌進行了分離與鑒定，并對病菌的生物學特性進行了初步研究，旨在為該病害的進一步防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采自豫北地區雞冠花苗圃內發病的雞冠花葉片，葉片上有直徑1～10 mm的橢圓形具模糊的同心輪紋狀壞死斑，病斑邊緣褐色至紫褐色。

1.2 病原的分離與鑒定

隨機選取帶有病斑的雞冠花病葉，在超凈工作臺上用75%乙醇擦拭后，在病健交界處劃取若干片4 mm2的小塊組織放入0.1%升汞中表面消毒約1 min，用無菌水沖洗2～3遍后接種到PDA培養基上，25 ℃培養。待長出菌絲后純化至新培養基平板上，直到獲得純培養。觀察病菌培養性狀，光學顯微鏡下觀察并描述其形態特征。

1.3 病菌致病性驗證

將經75%乙醇表面消毒的健康雞冠花葉片，平放在含苯并咪唑60 mg/L的培養基上。在每片葉子上接種2塊直徑為8 mm的菌塊，以不接菌塊為對照，25 ℃培養。待發病后取病健交界處葉片組織分離病原菌。

1.4 病菌生物學特性研究

1.4.1 不同培養基對病菌生長的影響

供試培養基[4]有PDA、燕麥粉瓊脂培養基(燕麥粉25 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)、雞冠花葉片汁液+PDA培養基、雞冠花葉片汁液+燕麥粉瓊脂培養基(雞冠花葉片20 g，燕麥粉25 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)、雞冠花葉片汁液+瓊脂培養基(雞冠花葉片20 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)。

1.4.2 光照對菌落生長的影響

用打孔器打直徑為3 mm的菌餅接于1.2.1篩選出的最佳培養基平板上，置于25 ℃人工氣候培養箱內，設定3種光照條件：全光照、全黑暗、半光半暗，每隔2 d測量菌落直徑[5]。

1.4.3 溫度對菌落生長的影響

接菌于1.2.1篩選出的最佳培養基上，每個平板接3塊。設15、20、25、30 ℃共4個溫度，每隔2 d測菌落直徑[6]。

1.4.4 溫度對分生孢子萌發的影響

將病葉在25 ℃保濕培養1 d，待產孢后制成孢子懸浮液(40倍鏡下每個視野中含有20～30個孢子)。設15、20、25、30 ℃共4個溫度梯度，以懸滴法做孢子萌發試驗，每隔2 h鏡檢1次，各處理觀察的孢子總數為300個左右，計算孢子萌發率。

1.4.5 營養對分生孢子萌發的影響

將病葉保濕培養后產生的孢子分別用蒸餾水、自來水、5%葡萄糖、5%蔗糖液配制孢子懸浮液(40倍鏡下每個視野中含有20～30個孢子)做孢子萌發試驗，12 h后觀察并計算孢子萌發率，各處理觀察的孢子總數為300個左右。

1.4.6 pH對分生孢子萌發的影響

用Na2HPO4、KH2PO4和檸檬酸配制pH為2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖溶液，用懸滴法25 ℃培養分生孢子，12 h后鏡檢孢子萌發率，各處理觀察孢子總數為300個左右。

1.4.7 光照對分生孢子萌發的影響

用懸滴法將孢子懸浮液(40倍鏡下每個視野中含有20～30個孢子)在25 ℃下培養，設定全光照、全黑暗、半光半暗3個處理，24 h后鏡檢孢子萌發率，各處理觀察的孢子總數為300個左右。

2 結果與分析

2.1 病菌特征描述

培養基上菌絲初為白色、絮狀，后期形成大量肉粉色至橙色孢子堆，光學顯微鏡下主要發現其大型分生孢子。分生孢子紡錘形、彎曲，具有明顯的背腹面、頂端和足細胞，成熟時具1～6個分隔(圖1)，成熟后分生孢子平均大小約為61.7 μm×7.3 μm；分生孢子梗上的瓶狀小梗平均大小約為18.98 μm×4.65 μm(圖1)；結合其菌落特征，根據Booth鐮刀菌分類系統[7]，鑒定該菌為硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum)。

圖1 病原菌形態Fig.1 Morphology of the pathogen

2.2 病菌致病性測定結果

將病菌回接雞冠花葉片發病后表現出與原采集病葉相同的癥狀。從病健交界處能夠再次分離得到原接種病菌，培養形狀和分生孢子形態與原接種病菌均一致。

2.3 病菌生物學特性

2.3.1 培養基對病菌生長的影響

從表1可以看出，在供試的5種培養基中，菌落的生長以雞冠花葉片汁液+燕麥粉瓊脂培養基最適宜，培養2 d后，菌落直徑顯著高于其他4個處理；其次是雞冠花葉片汁液+瓊脂培養基；菌絲在單純的燕麥粉瓊脂培養基上生長速度最慢。

表15種培養基對病原菌菌落生長的影響1)

Table1Theeffectsoffivemediaongrowthofthispathogenicfungus

培養基Medium菌落直徑平均值/mmAveragecolonydiameter1d2d3dPDA4．6bBC7．4cB8．4cB燕麥粉瓊脂培養基Oatmealagarmedium4．1cC6．5dC7．8dC含葉片汁液的PDALeafjuice?PDA5．1aAB7．5bcB8．6bcB含葉片汁液的燕麥粉瓊脂培養基Leafjuice?oatmealagarmedium5．3aA8．5aA9．3aA含葉片汁液的瓊脂培養基Leafjuice?agarmedium5．3aA7．9bAB8．9bAB

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.2 光照對菌落生長的影響

從表2可知，在3種光照處理下培養2 d時菌落的生長直徑差異不顯著，說明生長前期光照對該菌菌落生長影響不大，有無充足的光照該病菌均可生長。隨著培養時間增加，半光半暗的條件下最適合該病原菌的菌絲伸長和蔓延。

表2光照對菌落生長的影響1)

Table2Theeffectoflightingonthegrowthofcolony

光照條件Lighting菌落直徑/mmColonydiameter2d4d6d8d全光照Lightfor24h8．5aA9．8bB18．3bA15．9bA半光半暗Lightfor12h8．9aA12．6aA20．1aA16．8aA全黑暗Darkfor24h8．6aA10．6bB19．6aA16．2abA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.3 溫度對菌落生長的影響

由表3可知，該病原菌在15～30 ℃均可以生長，2 d后在25 ℃時生長最快，30 ℃時生長速度稍有下降但與25 ℃時差異不顯著。隨著培養時間的增加，25 ℃時的菌落生長直徑顯著高于其他3個處理。在4個溫度梯度下，病菌接種2 d后均可觀察到明顯的菌絲生長與擴散，但整體來看該菌的生長速度并不快。

表3培養溫度對菌落生長的影響1)
Table3Theeffectoftemperatureonthegrowthofcolony

溫度/℃Temperature菌落直徑/mmColonydiameter2d4d6d156．6bB8．0dD10．8cB206．9bB8．9cC11．6cB258．7aA12．8aA19．7aA308．3aA10．6bB18．8bA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.4 溫度對分生孢子萌發的影響

由表4可見：用懸滴法檢測分生孢子萌發率時，雞冠花褐斑病菌的分生孢子萌發主要集中在前12 h，這段時間中孢子萌發數量較多，12 h之后孢子萌發率增長較慢，在20 ℃時萌發效果最好。溫度太高反而抑制了分生孢子的萌發。

表4不同溫度下的孢子萌發率1)

Table4Thesporegerminationrateunderdifferenttemperatures

溫度/℃Temp?erature孢子萌發率/%Sporegerminationrate4h8h12h16h20h24h1541．3cC60．5dD82．4cB89．3cC95．4bA98．6bA2058．7aA80．3aA94．4aA98．6aA99．5aA100．0aA2549．6bB73．2bB89．7bA94．3bAB97．6abA99．2abA3048．5bB65．7cC88．6bA90．1cBC95．4bA98．9abA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.5 營養條件對分生孢子萌發的影響

從表5可以看出：在5%蔗糖溶液中分生孢子萌發率相對較高，顯著高于其他3個處理，分生孢子在5%葡萄糖溶液中也有較高的萌發率，在自來水中萌發率顯著低于其他處理。

表5分生孢子在不同營養液內的萌發率1)

Table5Thegerminationrateoftheconidiaunderdifferentnutrientsolutions

處理Treatment萌發率/%Germinationrate蒸餾水Distilledwater89．1bA自來水Tapwater64．0cB5%葡萄糖溶液5%Glucosesolution90．3bA5%蔗糖溶液5%Sucrosesolution95．0aA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.6 pH對分生孢子萌發的影響

從表6可以看出，雞冠花褐斑病菌的分生孢子在酸性、中性、堿性條件下均能萌發，但在酸性條件下更好，萌發率更高，萌發最適pH在5.0左右。

表6不同pH下分生孢子的萌發率1)

Table6ThegerminationrateoftheconidiaunderdifferentpHvalues

pH萌發率/%Germinationrate2．556．2dC3．081．3cB4．089．7aA5．089．9aA6．085．5bAB7．085．9bAB對照CK(5．5)87．6abA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.7 光照對孢子萌發的影響

由表7可知，3種光照條件下病菌分生孢子萌發率均超過了80%，不同的光照時間對孢子萌發率的影響差異不顯著，這表明雞冠花褐斑病菌的分生孢子萌發受光照時間的影響不大，對光照條件要求不嚴格。

表7分生孢子在不同光照條件下的萌發率1)

Table7Thegerminationrateoftheconidiaunderdifferentlightingconditions

處理Treatment萌發率/%Germinationrate全光照Lightfor24h84．2aA半光半暗Lightfor12h85．6aA全黑暗Darkfor24h82．7aA

1) 數據后小、大寫英文字母分別表示0.05、0.01水平差異顯著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

3 討論

引起雞冠花褐斑病[8]的硫色鐮孢菌在添加了寄主葉片汁液的PDA培養基上生長較快，說明該病菌的生長可能與雞冠花葉片中的一些成分有關，汁液的存在刺激了病菌的快速生長。該病菌分生孢子能在較廣泛的酸度范圍內萌發，對營養、溫度和光照條件的要求不是特別嚴格。這與馬鈴薯干腐病菌硫色鐮孢的生物學特性[9]有相似之處。該試驗結果為雞冠花褐斑病的發病率高、傳播速度快的特點提供了理論依據。雞冠花褐斑病嚴重時葉片黃萎、過早凋落，嚴重影響光合作用和降低觀賞價值，直至影響到植株正常開花和結籽，導致主要藥用部分花和籽的產量降低，因此已成為雞冠花實際生產中影響產量和經濟效益的重要制約因素。分生孢子的萌發率高低對雞冠花褐斑病的發生輕重有重要影響，生產過程中可通過控制環境條件來減輕該病的發生，如：盡量采取澆灌方式，避免噴灌，降低葉表面濕度；遇到連陰雨天氣或空氣相對濕度較高時，及時噴灑殺菌劑預防等。

[1] 江蘇新醫學院.中藥大辭典(上冊)[M].上海: 上海科技出版社, 1977: 1211-1212.

[2] 李時珍.本草綱目[M].北京: 人民衛生出版社, 1979: 965-966.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京: 中國醫藥科技出版社, 2010: 181.

[4] 方中達.植病研究方法[M].北京: 中國農業出版社, 1998: 46-49.

[5] 陸寧.三七圓斑病病原菌分生孢子的生物學特性[J].中藥材, 2005, 28(9):748-750.

[6] 李金花, 柴兆祥, 王蒂.秦艽斑枯病病原菌鑒定及生物學特性研究[J].中藥材, 2007, 30(1):3-6.

[7] Booth C.鐮刀菌屬[M].陳其煐，譯.北京: 農業出版社, 1988.

[8] 歐陽秩, 吳邦承.觀賞植物病害[M].北京: 中國農業出版社, 1996.

[9] 楊志敏,畢陽,李永才,等.馬鈴薯干腐病菌硫色鐮孢的生物學特性[J].菌物學報, 2012, 31(4): 574-583.

Biologicalcharacteristicsofthepathogenicfungusofbrownspotofcockscomb

Liu Qili1,2,Zhang Jianxin3,Tian Xueliang1,Lang Jianfeng1

(1.SchoolofResources&EnvironmentalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China; 2.CollegeofAgronomyandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 3.CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China)

Celosiacristatais a widely cultivated ornamental and medicinal flower.Brown spot of cockscomb is one of the main diseases of cockscomb.In this study, the pathogenic fungus of brown spot of cockscomb from northern Henan Province,Fusariumsulphureum, was identified and its biological characteristics were determined.The clones of the pathogens grew better on the oatmeal agar medium added with leaf juice, and the optimum temperature was 25 ℃.The rate of spore germination was highest at 20 ℃ in acid environment.The rate of conidial germination in 5% sucrose solution was close to that in 5% glucose solution, and both rates were higher than those in tap water and distilled water, and the lighting had no effect on conidial germination.

brown spot of cockscomb; pathogenic fungus; bionomics

2013-05-14

： 2013-07-17

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD14B08)

S 436.8

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.018

聯系方式 E-mail:liuqili2002@163.com