侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定

趙汝娜，王 蓉，師迎春，張桂娟，原 鍇，范在豐，周 濤*

(1.中國農業(yè)大學植物病理學系，北京 100193；2.北京市植物保護站，北京 100029；3.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102600；4.北京市房山區(qū)植物保護站，北京 102488)

侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定

趙汝娜1，王 蓉1，師迎春2，張桂娟3，原 鍇4，范在豐1，周 濤1*

(1.中國農業(yè)大學植物病理學系，北京 100193；2.北京市植物保護站，北京 100029；3.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102600；4.北京市房山區(qū)植物保護站，北京 102488)

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是一種由粉虱傳播的RNA病毒，可以侵染番茄和辣椒等常見蔬菜，已在世界多地造成嚴重危害。2012年在北京市大興區(qū)調查蔬菜病毒病時發(fā)現(xiàn)保護地栽培的甜椒植株表現(xiàn)脈間褪綠癥狀，且植株上煙粉虱數(shù)量多，初步推測為ToCV危害。通過提取顯癥樣品總RNA，利用ToCV特異性引物進行反轉錄PCR，擴增得到463 bp的目標條帶。通過測序和核苷酸序列比對分析，表明該序列與國外已報道的ToCV HSP70h(the heat shock protein 70 homolog，熱激蛋白70家族)基因序列相似性為99%。這是對ToCV在我國侵染甜椒的首次報道。

番茄褪綠病毒； 甜椒； RT-PCR

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是危害世界許多地區(qū)多種作物的病毒，引起嚴重的褪綠和黃化病害，典型癥狀是植株下部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠，與缺素癥狀非常類似[1]。該病毒最初在20世紀90年代發(fā)現(xiàn)于美國[1]，目前已經蔓延至世界多地[2-5]。ToCV為長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)成員，傳播介體為粉虱，包括B型煙粉虱(Bemisiatabacibiotype B)、Q形煙粉虱(B.tabacibiotype Q)、A型煙粉虱(B.tabacibiotype A)、溫室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)和紋翅粉虱(T.abutilonea)，但不能通過汁液摩擦傳播。常見的寄主包括茄科(番茄、甜椒、煙草等)、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍雪科等多種植物[6]。

2012年，筆者在對常見蔬菜病毒病害的調查中，在北京先后發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)ToCV侵染典型癥狀的番茄和甜椒植株，其中ToCV對番茄植株的侵染已經報道[7]。發(fā)病的甜椒植株葉片呈現(xiàn)脈間黃化，變脆易折，嚴重者葉片呈黃褐色，甚至出現(xiàn)壞死。該癥狀與ToCV引起的病害典型癥狀一致[1]。采回發(fā)病甜椒樣品，提取總RNA經反轉錄PCR檢測、序列測定和比對分析，鑒定為ToCV。這是該病毒侵染甜椒在我國發(fā)生的首次報道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年10月在北京大興區(qū)甜椒種植大棚中采集表現(xiàn)典型脈間褪綠癥狀且?guī)в悬S褐色病斑的甜椒葉片，整理后一部分直接用于提取總RNA，其余存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取甜椒葉片總RNA。取癥狀典型的葉片于液氮中研磨，將0.1 g粉末轉入1.5 mL離心管中，迅速加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫放置5 min后離心，將上清液轉入1.5 mL離心管，加入 0.2 mL氯仿并混勻，室溫放置5 min。再次離心后，將上清液轉移至1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇并混勻。室溫放置30 min。離心后，用75% 乙醇洗滌沉淀。最后用無核酶的去離子水溶解。

1.3 反轉錄PCR、序列克隆和測定

在無核酶的離心管中加入總RNA(2 μg)，0.5 μL 10 μmol/L Oligo (dT) primer，0.5 μL 10 μmol/L Random hexamers primer和1 μL dNTP Mix (10 mmol/L)，用無核酶的超純水補充總體積至18.5 μL；65 ℃ 反應5 min，然后立即冰浴2 min。短暫離心后加入5 μL 5× first-strand buffer，0.5 μL RNAase Inhibitor和1 μL M-MLV反轉錄酶，充分混勻，37 ℃反應60 min。

將反轉錄得到的cDNA用Dovas等[8]報道的檢測ToCV的特異性引物ToC-5(5′-GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGT-3′)和ToC-6(5′-AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC-3′)進行PCR，擴增ToCV編碼的HSP70h基因部分序列。25 μL PCR反應體系如下：cDNA 2 μL，dNTPs (10 mmol/μL)0.65 μL，上游引物ToC-5和下游引物ToC-6各0.5 μL，10×反應緩沖液2.5 μL，TaqDNA Polymerase 0.25 μL(5U/μL)，ddH2O 18.6 μL。PCR反應條件為：94 ℃變性3 min，按下列條件進行35個循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃復性45 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。全部PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取約500 bp的目標條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pMD18-T載體(TaKaRa，大連)。轉化大腸桿菌DH5α。陽性克隆經驗證后，由華大基因公司進行測序獲得序列。

1.4 序列比對分析

利用NCBI序列比對工具BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序nucleotide blast比對分析克隆獲得的序列，根據相似性確定病毒種類。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測

以反轉錄得到的cDNA為模板，利用ToCV的特異性引物ToC-5和ToC-6進行PCR檢測，從表現(xiàn)典型癥狀的甜椒樣品中擴增得到約450 bp的條帶，與感染ToCV的番茄陽性對照樣品[7]的擴增結果一致(圖1)。結果表明采集的甜椒樣品可能被ToCV侵染危害。

圖1 利用RT-PCR在甜椒樣品中檢測ToCVFig.1 Detection of ToCV on sweet pepper samples using RT-PCR

2.2 ToCV北京分離物部分序列分析

將PCR擴增獲得的約450 bp的片段純化，克隆到pMD18-T載體并進行序列測定。經BLAST程序nucleotide blast進行序列相似性檢索和分析的結果表明：檢測為陽性的來自北京郊區(qū)的甜椒樣品cDNA擴增得到的候選病毒基因組部分序列，與ToCV序列相似性最高，均為99%，表明在北京郊區(qū)甜椒生產大棚中采集的甜椒樣品確系被ToCV感染。

3 討論

雖然國外已經有較多研究和報道[1-6]，在我國ToCV是最近被發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，其在我國的發(fā)生和危害情況需要開展詳細的調查和研究。ToCV引起的葉片褪綠黃化癥狀類似于植株缺素癥狀，導致在病害調查中不易對其發(fā)生進行正確判斷。雖然ToCV引起的褪綠黃化病不導致絕產，但其引起的損失多在30%～40%，減產明顯[9]。因ToCV的傳播介體煙粉虱食性雜，在多種作物及雜草上極為常見[10]，尤其在保護地栽培條件下可以周年發(fā)生，所以導致這類褪綠黃化病毒病大面積發(fā)生和蔓延的可能性非常高。

由煙粉虱傳播的病毒病已給我國番茄等茄科作物生產造成嚴重損失，其中最為典型的病害是由番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)等一些雙生病毒引起的番茄黃化曲葉病毒病，但TYLCV侵染甜椒一般不引起明顯的癥狀，對甜椒產量的影響也不明顯[11]，所以目前在甜椒生產中一般不注意防治煙粉虱。隨著ToCV的發(fā)生，其對甜椒生產的危害將逐漸增加，如不加以重點防范，必將在生產上造成嚴重損失。由于國內外目前沒有對ToCV的抗病品種，生產中應注意采取綜合措施防治煙粉虱和該病毒的發(fā)生和傳播。防治策略和方法可以參照許多文獻中介紹的番茄黃化曲葉病毒病的綜合防治方法，主要措施是培育無毒幼苗，防治煙粉虱和清除其他寄主。

[1] Wisler G C, Li R H, Liu H Y, et al.Tomatochlorosisvirus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato[J].Phytopathology, 1998, 88(5): 402-409.

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[3] Lozano G, Moriones E, Navas-Castillo J.Complete sequence of the RNA1 of a European isolate ofTomatochlorosisvirus[J].Archives of Virology, 2007, 152(4): 839-841.

[4] Kataya A, Stavridou E, Farhan K, et al.Nucleotide sequence analysis and detection of a Greek isolate ofTomatochlorosisvirus[J].Plant Pathology, 2008, 57(5): 819-824.

[5] Wintermantel W M, Wisler G C, Anchieta A G, et al.The complete nucleotide sequence and genome organization ofTomatochlorosisvirus[J].Archives of Virology, 2005, 150(11): 2287-2298.

[6] Wintermantel W M, Wisler G C.Vector specificity, host range, and genetic diversity ofTomatochlorosisvirus[J].Plant Disease, 2006, 90(6): 814-819.

[7] Zhao R, Wang R, Wang N, et al.First report ofTomatochlorosisvirusin China[J].Plant Disease, 2013(doi.org/10.1094/PDIS-12-12-1163-PDN).

[8] Dovas C I, Katis N I, Avgelis A D.Multiplex detection of criniviruses associated with epidemics of a yellowing disease of tomato in Greece[J].Plant Disease, 2002, 86: 1345-1349.

[9] Hanafi A.Invasive species: a real challenge to IPM in the Mediterranean region? [R].European Whitefly Studies Network Newsletter no.13.John Innes Center, Norwich (GB),2002:4.

[10]De Barro P J, Liu S, Boykin L M, et al.Bemisiatabaci: a statement of species status[J].Annual Review of Entomology, 2011, 56: 1-19.

[11]Morilla G, Janssen D, García-Andrés S, et al.Pepper (Capsicumannuum) is a dead-end host forTomatoyellowleafcurlvirus[J].Phytopathology, 2005, 95(9): 1089-1097.

MolecularidentificationofTomatochlorosisvirusonsweetpepper

Zhao Runa1,Wang Rong1,Shi Yingchun2,Zhang Guijuan3,Yuan Kai4,Fan Zaifeng1,Zhou Tao1

(1.DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 2.BeijingStationofPlantProtection,Beijing100029,China; 3.DaxingStationofPlantProtectionandQuarantine,Beijing102600,China;4.FangshanStationofPlantProtection,Beijing102488,China)

Tomatochlorosisvirus(ToCV), a RNA virus transmitted by whiteflies, induces severe damage to tomato and pepper production in the world.In a survey of virus disease on vegetables in 2012, a yellowing disease was found on greenhouse grown pepper plants in Daxing district, Beijing.Meanwhile, a large number of whiteflies (Bemisiatabaci)were found on pepper plants.We suspected the diseased pepper plants were infected by ToCV.A Reverse Transcript-PCR assay was performed with total RNA isolated from diseased samples using specific primers for ToCV.Amplified DNA fragments (463 bp) were obtained.The nucleotide sequences of the fragments had the highest identity (99%) with that of ToCV.To our knowledge, this is the first report of ToCV on pepper in China.

Tomatochlorosisvirus; sweet pepper; RT-PCR

2013-04-02

： 2013-04-28

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303028)；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT1042)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.024

* 通信作者 E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn