地黃對百草枯解毒機理的研究

徐 鳳，楊德亮，楊 杰，劉 秀，張 闖，吳明根

(延邊大學農學院，延吉 133000)

地黃對百草枯解毒機理的研究

徐 鳳，楊德亮，楊 杰，劉 秀，張 闖，吳明根*

(延邊大學農學院，延吉 133000)

地黃對百草枯表現出較強的耐藥性，百草枯分別處理300 g/hm2或600 g/hm2時，藥害等級分別為0級和2級，且藥害癥狀恢復較快。研究結果表明，地黃塊根、葉片乙醇提取物的DPPH自由基清除率隨著提取物濃度的增加而增高；葉片對DPPH自由基的清除效果好于塊根，DPPH自由基清除率為50%時所需的地黃塊根、葉片乙醇提取物濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L。可以推測，地黃對百草枯的解毒是因為體內含有抗氧化活性物質，這種物質遇到百草枯時能夠解除百草枯活性氧毒性，起到地黃對百草枯的解毒作用。

地黃； 百草枯； 抗氧化

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)為玄參科地黃屬植物，是一種傳統(tǒng)的中藥植物資源。具有較強的抗氧化性，目前地黃規(guī)模化栽培中遇到除草難或除草劑殘留問題。

百草枯(paraquat)屬于高氧化活性的滅生性除草劑，在土壤中易失去活性，無殘留[1]。已有研究表明適量百草枯處理對地黃的生長和產量沒有顯著影響，因此可作為地黃田的特用除草劑[2-3]。研究顯示，地黃同科的玄參科多數植物提取物-梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等具有清除DPPH自由基能力的抗氧化特性[4-6]。

植物對氧化性除草劑百草枯的耐性機理大體分為兩種類型，一是由植物結構特異而產生對百草枯體內吸收、傳導的障礙性，二是由植物體內含有的抗氧化物質而產生的對百草枯氧化性的解毒作用。但目前為止，地黃對百草枯的耐性機理尚不清楚，對此，本文通過對地黃對百草枯解毒機理的研究，為使用高效、低殘留百草枯除草劑防除地黃地雜草提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

地黃[RehmanniaglutinosaLibosch.]：河北省引種品種(代號85-5)。大豆品種：‘黑農48’。

1.1.2 供試除草劑與試劑

百草枯:由先正達南通作物保護有限公司提供。二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):由日本東京化成工業(yè)株式會社提供，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、99.5%乙醚均為分析純。

1.1.3 供試儀器

UV-1700 PharmaSpec型分光光度計，CPA 324S型電子天平，EYEL4型減壓旋轉蒸發(fā)儀，SI500型軌道振蕩箱，多功能粉碎機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 地黃對百草枯的耐性鑒定

地黃出苗后20 d進行百草枯田間莖葉處理，劑量分別為300、600 g/hm2，噴水處理設為對照。各處理重復3次，小區(qū)面積0.01 hm2。施藥后第10、20天和40天分別調查藥害癥狀。

1.2.2 地黃提取物對百草枯的解毒性測定

將20%百草枯1 mL與不同量的地黃塊根提取液(1.2.3中的地黃樣品待測液)混合，加水定容100 mL，利用微型噴霧器均勻噴灑到2個復葉長出的大豆葉片上，施藥后第20天分別調查藥害癥狀。

1.2.3 地黃提取物清除DPPH自由基能力測定

DPPH貯備液的配制：稱取DPPH試劑0.128 8 g，用95%乙醇溶解、定容500 mL，得到質量濃度為257.7 mg/L 的DPPH貯備液(約6.5×10-4mol/L)備用[7]。

地黃提取、待測液的配制：將鮮地黃塊根(10月18日取樣)和葉片(7月9日取樣)在烘干箱中60 ℃烘干72 h后進行粉碎過篩(40目)，稱取過篩根葉各10 g,分別以蒸餾水、80%乙醇溶劑靜置浸24 h,然后在30 ℃、15 000 r/min條件下的振蕩器中振蕩24 h，過濾，將提取液減壓蒸發(fā)濃縮，定容待測。

清除DPPH自由基能力的測定: 將DPPH貯備液用95%乙醇稀釋至質量濃度為51.54 mg/L使用。在試管中依次加入2.0 mL 51.54 mg/L DPPH 溶液和2.0 mL樣品提取、稀釋溶劑(80%乙醇)，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為A0；在試管中依次加入DPPH 溶液的溶劑(95%乙醇)和2.0 mL待測試液，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為Ar；在試管中依次加入2.0 mL 51.54 mg/L DPPH溶液和2.0 mL待測試液，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為As。

按式(1)計算自由基清除率(Y)。

Y=1-(As-Ar)/A0

(1)

將待測地黃提取液配制成系列溶液，測定其DPPH自由基清除率，并繪制DPPH自由基清除率的提取液濃度曲線，用方程計算出當DPPH自由基清除率為50%時所需的提取液濃度(地黃材料重量/提取液體積)。

2 結果與分析

2.1 百草枯除草劑處理對地黃、大豆的藥害觀察

百草枯處理后調查藥害癥狀、等級結果(表1)，高劑量百草枯莖葉處理初期出現葉邊緣枯萎的藥害癥狀，藥害等級相當于2級(0～10級分類法[8])，第20天后藥害癥狀消失，恢復正常生長。當百草枯與地黃塊根提取液混合處理大豆幼苗時，地黃提取液表現解毒百草枯活性氧的抗氧化特性(表2)。因此認為，地黃植株體內含有抗氧化活性物質，這種物質遇到百草枯時能夠解除百草枯活性氧毒性。

表1地黃生長期百草枯處理的藥害癥狀及等級

Table1ThephytotoxicitysymptomsandgradeofR.glutinosaingrouingperiodbyparaquat

處理劑量/g·hm-2Dosage藥害等級(0～10級)Gradeofphytotoxicity(0～10)10d20d40d癥狀Phytotoxicitysymptom300000無600200葉邊緣，葉尖枯萎

表2百草枯和地黃塊根提取液混合處理的大豆葉片的藥害癥狀

Table2Thephytotoxicitysymptomsofsoybeanleavestreatedwithparaquatmixedwithrehmanniarootextracts

地黃塊根提取液/mLRehmanniarootextract百草枯/mLParaquat00．10葉片正常葉片全部枯死3葉片正常葉片大面積枯萎30葉片正常葉片少許枯黃100葉片正常葉片正常

2.2 DPPH吸光值與濃度關系

將257.7 mg/L DPPH貯備液用95%乙醇稀釋配成濃度梯度為206.16、103.08、51.54、41.23、20.62和10.31 mg/L的DPPH溶液，測吸光值(A)[9]。以吸光值(A)對DPPH濃度(C)作圖，得到Y(A)與X(C)的線性關系方程(圖1)。

圖1 DPPH濃度和吸光度的線性關系Fig.1 Linearity correlation between DPPH concentration and absorbency

2.3 地黃塊根、葉片提取液清除DPPH自由基的效果

測定結果(圖2)表明，地黃塊根、葉片提取物的DPPH自由基清除率都隨著提取物濃度的增加而增高；利用方程式計算DPPH自由基清除率為50%時所需的提取液濃度，地黃塊根、葉片提取物濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L,說明地黃葉片清除DPPH自由基的效果好于塊根。

圖2 地黃塊根(a)和葉片(b)提取液濃度與DPPH清除率的線性關系Fig.2 Linearity correlation between ethanol extracts of rehmannia fresh roots and leaves and DPPH clearance rate

3 討論與結論

除草難嚴重阻礙長白山區(qū)藥用植物大規(guī)模栽培[10]。本試驗結果表明，河北省引種的適宜延邊地區(qū)栽培的地黃品種(代號85-5)對除草劑百草枯具有較強的耐藥性，在推薦使用劑量(300～400 g/hm2)范圍內使用時對地黃無藥害癥狀。

通過觀察DPPH溶液在280～600 nm波長區(qū)間的掃描光譜，得到兩個特征吸收峰(329.5 nm)和(513 nm)，加入抗氧化劑抗壞血酸兩個吸收峰都降低，且513 nm處降低較顯著，故選用可見光513 nm處吸收峰的變化來表示DPPH含量的變化，用以評價地黃提取物的清除DPPH自由基抗氧化能力，這與陳叢瑾[7]等和Larrauri[11]等報道的DPPH吸收峰在517 nm略有差異。DPPH穩(wěn)定性試驗結果吸光值A值在最初20 min內下降較快，在20～40 min內，反應體系的A值變化緩慢，45 min后A值基本保持不變。因此測定時間為DPPH與提取物反應后的50 min。測定結果，地黃塊根、葉片乙醇提取物的DPPH自由基清除率都隨著提取物濃度的增加而增高；葉片對DPPH自由基清除效果好于塊根，DPPH自由基清除率為50%時所需的提取液濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L。

以上研究結果說明，地黃植株體內含有抗氧化活性物質，這種物質遇到百草枯時能夠解除百草枯活性氧毒性，從而起到對百草枯的解毒作用。

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DetoxicationmechanismofRehmanniaglutinosatoparaquat

Xu Feng，Yang Deliang，Yang Jie，Liu Xiu，Zhang Chuang，Wu Minggen

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133000,China)

Rehmanniaglutinosashowed tolerance to paraquat.The phytotoxicity ofR.glutinosawas grade 0 and grade 2 with paraquat at 300 g/hm2or 600 g/hm2, respectively.The results showed that the DPPH free radical scavenging activity of ethanol extract fromR.glutinosaroot tubers and leaves increased with the extractive concentration adding; the DPPH scavenging effect in the leaves was better than that in the root tubers.The concentrations ofR.glutinosaroot tubers and leaves extracted with ethanol were 20.0 g/L and 12.2 g/L, respectively, when the DPPH free radical scavenging activity was 50%.In general, the detoxication ofR.glutinosato paraquat was caused by the antioxidant substance which could remove paraquat reactive oxygen toxicity.

Rehmanniaglutinosa； paraquat； antioxidant

2013-01-21

： 2013-04-07

國家自然科學基金(31160370)

S 481.4

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.026

* 通信作者 Tel:0433-2435566; E-mail：5minggen@163.com