球孢白僵菌液體生長營養和培養條件優化

張亞平, 吳圣勇, 王海鴻, 雷仲仁

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

球孢白僵菌液體生長營養和培養條件優化

張亞平, 吳圣勇, 王海鴻, 雷仲仁*

(中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

以菌株液體發酵過程中菌絲干重和芽生孢子濃度為測試指標，對球孢白僵菌DZDC-9菌株液體發酵營養需求進行優化，結果表明，菌株生長的適宜碳源為葡萄糖，適宜氮源為酵母粉，在基礎培養液中添加0.000 5 mol/L KCl可以顯著提高菌絲和芽生孢子濃度。通過單因素分析和正交設計對不同培養條件下菌絲生長量進行測定，結果表明，在培養溫度26 ℃，培養液裝樣量1/5，初始接菌量107個/mL，轉速200 r/min的培養條件下，菌株液體發酵能在60 h達到最大菌絲生長量(13.184±0.328 6)g/L。利用篩選出的培養基和培養條件進行液固雙相發酵試驗，得到的孢子粉產量為(22.30±1.78)g/kg大米，顯著高于優化之前的產量(13.04±1.90)g/kg大米。

球孢白僵菌; 液體發酵; 營養需求; 培養條件; 產孢量

近年來，隨著害蟲抗藥性的增加，生物防治逐漸成為人們的研究熱點，其中蟲生真菌受到人們的關注，而球孢白僵菌作為一種廣譜性的昆蟲病原真菌，可以用于控制多種有害生物[1]，并逐漸成為可以替代化學農藥的商業化產品[2]。與傳統化學農藥相比，白僵菌不僅對環境安全，對非靶標生物無害，還可以借助蟲體繁殖，引起再次侵染[3]。如何大量繁殖球孢白僵菌便成為菌株推廣應用的基礎和前提。

國內外對于白僵菌的生產進行了多方面的研究，加拿大Goettel[4]使用淺盤、麥麩、玻璃紙和高壓尼龍袋的方法生產菌粉，玻璃紙作為一種半透膜，隔絕菌體和培養基，以此獲得純孢粉。胡加付[5]等利用低值農副產品為載體，利用淺盤發酵法對固體發酵的條件和載體配比進行了優化，以此獲得了大量原孢粉。Rombach[6]利用液體深層培養的方式獲得液生分生孢子，Pham[7]等對液體深層培養產孢條件進行了優化，獲得了液生分生孢子大量生產的優化條件，周曉妹[8]也對白僵菌液體深層培養方式進行了優化，篩選了適合液體深層發酵的培養基和培養條件。無論是固體發酵還是液體發酵都存在一定缺陷，無法滿足擴大生產高純白僵菌孢子粉的需求，目前研究應用較多的是液固雙相發酵產孢，充分結合兩者的優勢，首先利用液體發酵生產大量的菌絲體和芽生孢子，再通過固體載體接種培養、干燥和分離，最后得到大量分生孢子[9]。而菌絲體和芽生孢子對后期固體接種產量的提高有顯著性影響，如何快速獲得大量菌絲體和芽生孢子對于縮短發酵時間和提高發酵產量是非常重要的。目前研究較多的主要是固體接種材料及培養條件對發酵產量的影響[10-11]，液體發酵也主要以液體深層發酵獲得液生分生孢子或芽生孢子侵染體為目的進行研究[12-13]，生產周期較長，對于單純以獲得大量菌絲體和芽生孢子為目的，為后期固體接種提供發酵液的研究較少。

本試驗選用經過毒力測定對西花薊馬有高效致病力的球孢白僵菌DZDC-9為供試菌株，以快速獲得菌絲和芽生孢子產量為目的，采用單因素分析的方法從營養和培養條件兩方面對球孢白僵菌液體發酵階段生長的影響因子進行研究，對篩選出來的關鍵因子進行正交設計，篩選出適合液體培養的優化組合培養條件，以期快速獲得大量菌絲和芽生孢子，為后期固體接種提供優質發酵液，再通過后期培養驗證，以期提高后期發酵產量。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗所用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)DZDC-9菌株分離自被感染的亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)蟲體，經過毒力測定該菌株對西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)有高致病力，保存于中國農業科學院植物保護研究所蔬菜害蟲組。

1.2 供試培養基

產孢培養基：2%玉米粉、1%麥麩、0.5%蛋白胨、0.3% KH2PO4、0.1% NH4NO3、0.1% MgSO4·7H2O、2%瓊脂粉，121 ℃高溫滅菌15 min，倒在直徑9 cm的無菌培養皿中，凝固后備用。

液體培養基：4%葡萄糖、1%蛋白胨，自然pH(經pH計測定為6.5)，121 ℃高溫滅菌15 min。

試劑：試驗所用KH2PO4、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KCl、葡萄糖均為國產分析純，麥麩和玉米粉為農貿市場出售，瓊脂粉為日本進口，蛋白胨為進口OXOID LP0042。

1.3 菌株活化與培養

菌株活化培養：取保存于4 ℃的DZDC-9菌株，采用畫線法接種于產孢培養基，于26 ℃恒溫培養箱(GXZ-9240A型)半光照L∥D=12 h∥12 h培養7 d，待長出淡黃色分生孢子粉時備用。

孢懸液的制備：取活化培養的分生孢子粉加入0.05%吐溫-80無菌水中，使用漩渦振蕩儀振蕩使孢子分散均勻，制得孢懸液。

萌發率測定：取少量孢懸液加入裝有15 mL液體培養基的50 mL三角瓶中，置于26 ℃、150 r/min恒溫搖床培養16 h后，取少量培養液滴于血球計數板，顯微鏡(OLYMPUS DP72)40倍下鏡檢，每次計數100個孢子，長出芽管的記為已萌發，重復3次，測定孢子萌發率在95%以上，孢子粉可以使用。

1.4 菌絲生長量和芽生孢子濃度的測定

菌絲生長量測定：取液體發酵菌液2 mL于離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，沉積物倒在干燥的濾紙(提前烘干至恒重并稱重記為W1)，80 ℃烘干至恒重，快速稱重W2，以菌絲干重來衡量菌株的生長多少，W=(W2-W1)×500 g/L。

芽生孢子濃度的測定：取液體發酵菌液1 mL加入9 mL蒸餾水進行稀釋，使菌絲與芽生孢子分散均勻，取少量混合液滴于血球計數板，顯微鏡40倍下計數芽生孢子濃度。

1.5 不同碳氮源種類對球孢白僵菌菌株液體培養的影響

氮源種類的影響：分別以牛肉膏和酵母粉為氮源代替液體培養基中的蛋白胨，把50 mL培養液裝入250 mL三角瓶中，接入孢懸液使得培養濃度為107個/mL，置于26 ℃、200 r/min恒溫搖床(HZQ-F100振蕩培養箱)培養72 h后，測定菌絲生長量和芽生孢子濃度，重復3次。

碳源種類的影響：分別以甘露醇、蔗糖和麥芽糖為碳源代替液體培養基中的葡萄糖，把50 mL培養液裝入250 mL三角瓶中，參照固定碳源的培養方法測定菌絲生長量和芽生孢子濃度。

1.6 鉀對球孢白僵菌菌株液體培養的影響

在液體培養基中添加不同量的KCl，配成不同濃度的含鉀培養液(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mol/L)，把50 mL培養液(不同鉀濃度)裝入250 mL三角瓶中，參照1.5的培養方法測定菌絲生長量和芽生孢子濃度。

1.7 單因素分析法對球孢白僵菌菌株液體培養條件的篩選

采用單因素分析法對白僵菌液體發酵培養的條件初始pH、培養溫度、初始接菌量、培養轉速和液體裝樣量進行篩選。

搖瓶培養方法：取液體培養基50 mL裝入250 mL三角瓶滅菌備用，接入孢懸液使培養濃度為106個/mL，置于26 ℃、120 r/min的恒溫搖床培養，自培養開始，每隔12 h取樣測定菌絲生長量，重復3次，取平均值。

不同初始pH：通過在液體培養基中添加HCl和NaOH來調節初始pH分別為5、6、7、8，其余培養條件不變，測定不同初始pH對菌株生長的影響。

不同液體裝樣量：分別改變液體培養基裝樣量為1/3、1/4、1/5、1/6，其余培養條件不變，測定不同液體裝樣量對菌株生長的影響。

不同培養溫度：分別改變搖床培養溫度為24、26、28、30 ℃，其余培養條件不變，測定不同培養溫度對菌株生長的影響。

不同培養轉速：分別改變搖床培養轉速為100、200、300 r/min，其余培養條件不變，測定不同培養轉速對菌株生長的影響。

不同初始接菌濃度：分別在液體培養基接入定量孢懸液使得初始培養濃度為105、106、107、108個/mL，其余培養條件不變，測定不同初始接菌濃度對菌株生長的影響。

1.8 利用正交設計對篩選因子進行優化組合

通過單因素分析的方法，篩選對菌株液體生長有影響的因子：初始接菌量、液體裝樣量、轉速、溫度和初始pH，對其中有主要影響作用的接菌量、液體裝樣量、轉速，采用L9(34)的正交表進行3因子的正交設計試驗，每個因子取3個水平，試驗設計見表1，每組試驗重復3次，以培養60 h后的菌絲干重為菌株生長檢測指標。

1.9 優化結果對發酵產量的影響

以優化得到的培養基成分和培養條件進行液體發酵液培養，得到的培養液接種于固體培養基培養，以大米為固體載體，大米制備和接種培養參照李銀平[14]的生產培養方式，以優化前的培養基(4%葡萄糖、1%蛋白胨)和培養方式(初始接種106個/mL、裝樣2/5、26 ℃、轉速120 r/min)[14]為對照進行固體接種培養，試驗分3次進行，每次每個處理培養大米10 kg，使用15 cm×30 cm保鮮袋每袋裝大米200 g,接種15%的液體發酵液，26 ℃半光照L∥D=12 h∥12 h培養7 d，培養結束后，對產孢量和培養過程菌米的污染情況以及孢子粉的含孢量、含水量、萌發率進行檢測。

產孢量：把培養好的菌米用收孢機(Mycoharvester Company,UK)進行孢子粉的分離，得到的孢子粉稱重，換算成每千克大米的產孢量(g/kg)。

含孢量：準確稱取孢子粉10 mg加入100 mL0.05%吐溫-80溶液中，使用振蕩儀充分振蕩使孢子成單孢分散，用血球計數板40倍鏡檢孢懸液濃度，換算成每克孢子粉所含有的孢子個數(個/g)。

含水量：用水分測定儀(FD-C1 13060325)測定孢子的含水量。

萌發率：參照1.3的方法。

雜菌污染率：培養結束后，保鮮袋中培養的大米出現雜菌記為污染，統計被污染的菌米袋數占培養總袋數的百分比。

1.10 數據處理分析

試驗所得數據通過SPSS 13.0進行差異顯著性分析和正交設計分析，所得數據通過SigmaPlot 12.5作圖。

2 結果與分析

2.1 不同碳氮源對球孢白僵菌菌株液體培養的影響

不同氮源影響白僵菌菌株液體生長情況如圖1顯示，3種有機氮源對白僵菌菌株DZDC-9菌絲生長(F=100.658，P<0.000 1)和芽生孢子濃度(F=327.015，P<0.000 1)有顯著性差異，其中菌株在以酵母粉為氮源的培養液中生長量和芽生孢子濃度均最大，72 h菌絲干重達到(11.602±0.003 8)g/L，芽生孢子濃度(2.875±0.137 7)×107個/mL，顯著優于蛋白胨和牛肉膏，說明酵母粉是菌株DZDC-9液體發酵的適合氮源。

圖1 不同氮源對DZDC-9菌株液體生長的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain DZDC-9

不同碳源對菌株的液體生長影響不同，試驗結果如圖2所示，4種不同碳源條件下，菌株DZDC-9菌絲生長(F=10.749，P<0.004)和芽生孢子濃度(F=60.397,P<0.001)均有顯著性差異，其中菌株在以蔗糖為碳源的培養液中生長量最大，72 h干重達到(12.606 7±0.747 2)g/L，但芽生孢子濃度顯著低于其他3種碳源；菌株在以葡萄糖為碳源的培養液中芽生孢子濃度最大，72 h芽生孢子濃度達到(4.406 7±0.120 9)×108個/mL,在以葡萄糖為碳源的培養液中，菌絲干重的產量也相對較高，所以葡萄糖更適合菌株DZDC-9的液體發酵培養。

圖2 不同碳源對DZDC-9菌株液體生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the growth of strain DZDC-9

2.2 不同鉀濃度對球孢白僵菌菌株液體培養的影響

在培養液中添加不同濃度的KCl，菌株生物量(F=477.769,P<0.000 1)和芽生孢子濃度(F=97.553,P<0.000 1)有顯著性差異，如圖3所示隨著培養液中鉀離子濃度的增加，菌絲干重呈下降趨勢，當鉀離子濃度達到0.025 mol/L時，菌絲干重(15.291 3±0.123 7)g/L低于對照菌絲干重(16.324 0±0.140 1)g/L，芽生孢子濃度隨著鉀離子濃度的增大呈現先下降然后略微上升的趨勢，但在鉀離子濃度高于0.000 5 mol/L后菌絲干重和芽生孢子濃度都顯著低于對照，適量的鉀離子濃度(0.000 5 mol/L)對菌株DZDC-9液體發酵生物量和芽生孢子濃度有明顯的促進作用，反之則抑制菌株的生長。

圖3 不同KCl濃度對DZDC-9菌株液體生長的影響Fig.3 Effects of different KCl concentrations on the growth of strain DZDC-9

2.3 單因素分析法對球孢白僵菌菌株液體培養條件的篩選

采用單因素分析的方法分別對培養液初始pH、裝液量、培養溫度、轉速和初始接菌濃度進行分析，試驗結果如圖4～8，可以看出在液體培養的前36 h菌株生長速度快，36 h以后生長緩慢，60 h生長趨于平穩達到最高生長量，培養72 h菌株生長量略有下降，出現菌體自溶現象(通過培養液的觀察可以看到有少許分層現象出現)。試驗選取白僵菌菌株生長量最高點進行因子的顯著性分析，通過不同條件下菌株生長曲線可以看到菌株生長都在60 h穩定達到生長高峰。通過對不同培養條件下60 h菌體的生長量進行顯著性差異分析，其中液體裝樣量(F=7.381,P<0. 011)、溫度(F=11.836,P<0.003)、轉速(F=7.929,P<0.021)和接菌量(F=26.578,P<0.000 1)對菌株的液體培養有顯著性影響，而初始pH(F=2.653,P>0.05)則對菌株生長沒有顯著性影響，在菌株液體培養時選取液體培養基自然pH(6.5)進行培養即可，液體培養溫度選擇常規培養溫度26 ℃。

圖4 初始pH對菌株液體生長的影響Fig.4 Effects of different initial pH values on the growth of strain DZDC-9

圖5 裝樣量對菌株液體生長的影響Fig.5 Effects of different volumes of culture medium on the growth of strain DZDC-9

圖6 溫度對菌株液體生長的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the growth of strain DZDC-9

圖7 轉速對菌株液體生長的影響Fig.7 Effects of different rotation speeds on the growth of strain DZDC-9

圖8 不同接菌量對菌株液體生長的影響Fig.8 Effects of different spore concentrations on the growth of strain DZDC-9

2.4 利用正交設計對液體培養主要影響條件進行優化篩選

按照正交設計表L9(34)對白僵菌菌株的培養條件進行優化組合，所得結果見表1和表2，對試驗的不同組合之間進行方差分析，不同培養方式菌株菌絲生長量有顯著性差異(F=644.546，P<0.000 1)，試驗編號8的組合方式顯著優于其他組合。對各因子進行主效應分析，從表2可以看出，初始接菌量對菌絲生長量有顯著影響，而培養基裝樣量和轉速對菌株生長的影響則不顯著，初始接菌量是影響菌株液體生長的最顯著因子。

2.5 優化后的發酵試驗驗證

分別以優化后的液體培養基和培養條件進行接種試驗，以優化前的基礎培養條件為對照，對收獲后的孢子粉進行質量檢測，結果如表3，可以看出優化后接種產孢量大幅度增加，與優化前在P=0.05水平上有顯著性差異，并且優化后接種在固體培養時，雜菌污染率大幅度降低，這主要是由于優化后培養得到的優質發酵液在固體培養的前期生長速度較快，抑制了雜菌的生長。

表1 菌株培養條件的正交設計表1)Table 1 The orthogonal array form of strain culture

1) 同列數據后不同字母表示經過Duncan氏多重比較在0.05水平上有顯著性差異。
Different lowercase letters indicate significant difference by Duncan’s test (P<0.05).

表2 正交試驗的主效應分析結果Table 2 The results of orthogonal array form

表3 優化培養條件的生產試驗1)Table 3 Experimental verification of yielding capacity under the optimized fermentation conditions

1) 同列數據后不同字母表示經過獨立樣本t測驗在0.05水平上有顯著性差異。
Different lowercase letters in the same column indicate significant difference by dependent samplet-test (P<0.05).

3 討論

不同菌株對碳氮源的需求和利用情況不同，微量元素的種類和添加量也會對菌株液體發酵產生影響，本試驗通過對球孢白僵菌菌株DZDC-9發酵生長營養需求的研究，發現適宜該菌株生長的碳源是葡萄糖，氮源是酵母粉，宋漳[15]研究發現葡萄糖、蔗糖和乳糖是白僵菌液體培養較好的碳源，樊金華等[16]的研究發現有機氮源更適合菌株液體發酵，孔瓊等[11]也研究表明葡萄糖和酵母浸粉最有利于菌落擴展和產孢量的增加，這與本試驗研究結果相符。朱天輝等[12]在球孢白僵菌的液體培養中添加了0.1%K2PO4得到了最大芽生孢子濃度，本試驗在液體培養基中添加KCl測定了鉀添加量對菌株液體生長的影響，研究表明在液體培養基中添加適宜濃度的KCl可以顯著提高菌絲和芽生孢子濃度。

對于發酵條件，本試驗首先通過單因子分析從5個方面進行優化，發現初始pH在5～8范圍對菌株生長沒有顯著性影響，孫明[17]等報道過球孢白僵菌的液體培養在pH為5～6的偏酸性環境下產孢量最大，這與本試驗結果存在一些差異，可能是不同菌株對pH的需求不同，在一定的pH范圍內菌株可以維持正常生長，過酸或者過堿的環境不利于菌株的生長和產孢。菌株生長的適宜溫度是26 ℃，Thomas[18]曾研究報道過適宜白僵菌液體生長的溫度為25 ℃。通過對轉速、接菌量和裝樣量進行正交設計，發現在初始接菌濃度107個/mL、轉速200 r/min、裝樣量1/5的培養條件下，菌株生長量最大，充分證明了合適的溶氧可以明顯促進菌株液體生長，過高或過低的接種量均不利于液體發酵生產，過高的接種量需要更多的種子懸浮液，但對于后期發酵液的產量并沒有顯著的增加作用，過低的接種量造成發酵周期延長。通過優化后的培養液進行固體接種試驗，并與優化前進行對比，不僅增加了菌株產孢量，后期固體接種的雜菌率也大幅降低。

球孢白僵菌對多種害蟲有控制效果，在生物防治中發揮著重要作用[19-20]。經過分離篩選得到對西花薊馬有高效致病力的菌株DZDC-9，對菌株的液體生長所需營養和條件進行優化篩選，為菌株DZDC-9的擴大生產和田間應用奠定基礎。經過本次的試驗優化，菌株的液體發酵需要60 h即可達到最大生長量，通過后期的接種試驗得到的孢子粉產量多于優化前的接種產量。除此之外，球孢白僵菌對于碳氮源的濃度需求也不盡相同，其他微量元素的添加對菌株生長的影響尚不明確，還需要做進一步的研究和探索，為球孢白僵菌的規模化生產提供更多的理論基礎。

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OptimizationofsubmergedcultureconditionsforblastosporeandbiomassproductionofBeauveriabassiana

Zhang Yaping, Wu Shengyong, Wang Haihong, Lei Zhongren

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China)

The principal objectives of this study were to determine the optimal liquid culture conditions in shake flasks for maximal biomass and blast spores ofBeauveriabassiana. The results showed that glucose was the suitable carbon source, and yeast powder was the suitable nitrogen source for the growth of strain DZDC-9. Adding 0.000 5 mol/L KCl into the submerged culture can significantly enhance the yield of biomass and blast spores. The biomass reached(13.184±0.328 6)g/L after 60 h. The best culture conditions were shake flasks with one-fifth nutrient solution and initial conidial concentration of 107spores/mL in a rotary shaking incubator at 200 r/min at 26 ℃, which could increase the biomass and shorten the incubation time. Using the selected nutrition and culture conditions to produce conidia, the yield could achieve 22.30±1.78 per kilogram of rice.

Beauveriabassiana; liquid fermentation; nutrition; culture condition; yield

2013-12-18

：2014-05-27

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-25)；北京市國家現代農業科技城產業培育專項(Z121100001212006)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.016

* 通信作者 E-mail: leizhr@sina.com