9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的室內毒力測定及配比試驗

唐爽爽， 劉志恒*， 余朝閣， 趙廷昌

(1. 沈陽農業大學植物保護學院,沈陽 110866; 2. 中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193)

9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的室內毒力測定及配比試驗

唐爽爽1， 劉志恒1*， 余朝閣1， 趙廷昌2

(1. 沈陽農業大學植物保護學院,沈陽 110866; 2. 中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193)

為篩選防治西瓜炭疽病的高效低毒殺菌劑，緩解和治理生產中病菌對藥劑的抗性，在室內離體條件下采用生長速率抑制法及孢子萌發抑制法測定了9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的毒力。結果表明，嘧菌酯、咪鮮胺和甲基硫菌靈對病原菌菌絲生長的EC50在0.093 3～0.118 2 mg/L之間，均小于1 mg/L，表明西瓜炭疽病菌對上述殺菌劑比較敏感；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的EC50在2.310 1～5.925 9 mg/L，病菌對藥劑的敏感程度相對較低；代森錳鋅、惡霉靈和多菌靈的EC50分別為36.876 3、74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌活性較差。孢子萌發試驗中，嘧菌酯、咪鮮胺和甲基硫菌靈對病菌孢子萌發的抑制活性最高，EC50在0.069 4～0.167 2 mg/L之間；百菌清、烯肟菌酯、代森錳鋅的抑制活性次之，EC50在1.853 0～9.503 9 mg/L之間；多菌靈的抑制活性相對最低，EC50為99.335 3 mg/L。將兩種不同作用機理的殺菌劑嘧菌酯與咪鮮胺按照2∶1的比例混配，聯合毒力測定和評價結果表明兩者混配對抑制西瓜炭疽病菌具有增效作用。

西瓜炭疽病菌； 殺菌劑； 毒力測定； 混配

西瓜是世界十大水果之一，據聯合國糧農組織(FAO)統計，西瓜在世界果品中占第5位，在夏季市場水果供應上居首位，被譽為“夏季水果之王”。我國是世界上最大的西瓜生產國，占世界總面積和總產量的45%以上[1]。西瓜炭疽病[Colletotrichumorbiculare(Berk.etMont.) Arx]是西瓜生產上重要病害之一，在世界各地西瓜栽培地區均有發生，尤其以濕度大地區發生最普遍。近年來，隨著全球變暖趨勢的加重以及西瓜種植面積的不斷增加，西瓜重茬面積不斷擴大，導致炭疽病日益加重。西瓜炭疽病一旦發生，就會造成嚴重減產，甚至絕收[2]。在遼寧省西瓜主產區遼中縣，西瓜炭疽病廣泛發生，對西瓜生產構成了嚴重威脅[3]。近年來，西瓜炭疽病在遼寧省建平縣露地西瓜栽培中有逐年加重的趨勢，已成為西瓜栽培生產中的3大主要病害之一，嚴重影響了西瓜的產量和品質[4]。

目前，國內外關于西瓜炭疽病菌的研究多側重于病害的發生原因與規律，有的已深入到分子水平[5]。生產上由于缺乏抗性品種，化學藥劑防治仍是控制病害的重要措施，但某種藥劑長期單一使用、用藥次數和劑量不斷增加，導致藥劑抗藥性出現的問題，已在很多病害防治中有所顯露而影響了病害防控效果。鑒此，本文選用9種殺菌劑原藥，采用菌絲生長速率抑制法和分生孢子萌發抑制法對西瓜炭疽病菌進行了室內毒力測定，并研究了殺菌劑混配的抑菌效果，以期為西瓜炭疽病的田間防治篩選出作用機制不同且高效、低毒的殺菌劑，為生產上減緩病菌抗藥性的產生以及病害的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種來源

2012年8月，于遼寧省沈陽新民市、營口蓋州市和阜新彰武縣采集西瓜炭疽病標樣，采用常規組織分離法[6]獲得病原菌，經致病性測定驗證。將病菌經純培養擴繁后保藏備用。

1.2 供試藥劑

選用生產上常規應用的9種殺菌劑：95%嘧菌酯原藥(湖北晟隆化工有限公司)、97%咪鮮胺原藥(湖北晟隆化工有限公司)、97%甲基硫菌靈原藥(江蘇省新沂利民化工有限責任公司)、98%百菌清原藥(山東華陽農藥肥料化工有限公司)、95%烯肟菌酯原藥(杭州中潤生物科技有限公司)、95%戊菌唑原藥(浙江省杭州宇龍化工有限公司)、80%代森錳鋅原藥(江蘇省新沂利民化工有限責任公司)、95%惡霉靈原藥(山東京博農化有限公司)及98%多菌靈原藥(上海臨空化工貿易有限公司)。

1.3 接種體及孢子懸浮液的制備

病菌培養：應用PSA培養基，將分離純化的病菌于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養15 d，用直徑7 mm的滅菌打孔器在菌齡相近、長勢一致的菌落部位打取菌餅備用。

菌懸液制備：取培養30 d的PSA平板，每皿加入無菌水5 mL，配成分生孢子懸浮液，孢懸液濃度為40倍鏡下平均每視野60～80個孢子[7]。

1.4 試驗方法

對西瓜炭疽病菌的室內毒力測定，分別采取菌絲生長速率抑制法[8]和孢子萌發抑制法[9]進行篩選，計算9種供試殺菌劑的抑制中濃度(EC50)。

菌絲生長速率抑制法：根據預試驗結果，選擇各藥劑適當的5個濃度(表1)，將配制好的供試藥劑母液按照設定的濃度比例加入到已融化并冷卻至50 ℃左右的PSA培養基中，充分混勻后分別倒入直徑9 cm的滅菌培養皿中，制成系列濃度的含藥PSA平板。以不加藥劑但含等量溶劑的PSA平板為對照。接入直徑7 mm的菌餅，25 ℃恒溫培養。每處理設3次重復。15 d后采用十字交叉法測定菌落直徑[10]，并計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

分生孢子萌發抑制法：根據預試驗結果，選擇各藥劑適當的5個濃度(表2)，孢懸液濃度為40倍鏡下60～80個孢子，分別吸取孢懸液0.5 mL與配制好的待測農藥母液(含2%葡萄糖)0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌發法。無菌水為對照。25 ℃恒溫保濕培養。每處理3次重復。12 h后測定孢子萌發率。每個處理隨機鏡檢100個分生孢子，記載孢子萌發數。

孢子萌發率(%)=已萌發孢子數/鏡檢孢子總數×100；

孢子萌發抑制率(%)=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/對照孢子萌發率×100。

2種殺菌劑混配效果測定：根據單劑毒力測定結果，對毒力最高的2種藥劑95%嘧菌酯和97%咪鮮胺進行混配[11]，有效成分配比為：4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，每個配比配制成相應5個濃度梯度。采用生長速率法對西瓜炭疽病菌進行聯合毒力測定。計算混配劑對菌絲生長抑菌率，分別求得藥劑不同混配比例的毒力回歸方程、EC50和相關系數。并根據Wadley公式計算增效系數SR[12]，確定不同比例混劑的相互作用。

EC50理論值 =(a+b)/〔(a/EC50A)+(b/EC50B)〕

SR=EC50(理論值)/EC50(實際值)

式中A、B分別為95%嘧菌酯和97%咪鮮胺單劑；a、b分別為相應單劑在混劑中含量的比率；以SR值代表相互作用程度。當SR≤0.5時，表示拮抗作用；當SR≥1.5時，表示增效作用；當SR在0.5～1.5之間時，表示加和作用。

1.5 數據處理與統計分析

采用DPS統計軟件和Excel軟件對測定數據進行處理和計算[13]，將菌絲生長抑制率和孢子萌發抑制率分別換算成幾率值(y)，藥劑濃度換算成濃度對數(x)，按濃度對數與幾率值回歸法求得線性回歸方程(毒力回歸式)y=a+bx，并以回歸方程計算各供試藥劑對西瓜炭疽菌菌絲生長和分生孢子萌發的抑制中濃度(EC50)、幾率值與濃度對數之間回歸的相關系數r值，比較不同殺菌劑對西瓜炭疽病菌的抑制作用。

2 結果與分析

2.1 9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌菌絲生長的影響

不同濃度的殺菌劑與其對西瓜炭疽病菌的抑制率之間是一種不對稱的S形曲線關系，將濃度轉化為對數，抑制率轉化為幾率值時，濃度與抑制率之間表現為一元線性回歸關系，通過相關性分析，可以檢驗線性關系的顯著性，分析比較殺菌劑對病菌的毒力。

各供試藥劑供試濃度、毒力回歸方程、相關系數r和EC50結果見表1。

表1 供試9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Toxicity of nine fungicides on mycelium growth of Colletotrichum orbiculare

根據菌絲生長抑制法測定的EC50結果(表1)表明，供試9種殺菌劑基本歸為4類：95%嘧菌酯、97%咪鮮胺和97%甲基硫菌靈，EC50分別是0.093 3、0.108 3和0.118 2 mg/L，比其他供試藥劑的EC50小，說明這3種藥劑抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、95%戊菌唑，EC50介于2.310 1～5.925 9 mg/L之間，在供試藥劑中EC50較小，說明這3種藥劑抑菌效果較好；80%代森錳鋅EC50為36.876 3 mg/L，說明該藥劑抑菌效果一般；95%惡霉靈和98%多菌靈的EC50分別為74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌效果很差。

回歸方程的斜率與殺菌劑對病菌的敏感性成正比。按回歸方程的斜率k，供試藥劑可以分為2類：95%戊菌唑、97%甲基硫菌靈、95%烯肟菌酯、98%百菌清、98%多菌靈、95%嘧菌酯和97%咪鮮胺，斜率k在1.028 2～1.380 3之間，是供試藥劑中斜率k較大的，說明西瓜炭疽病菌對這7種藥劑的敏感性較高；95%惡霉靈、80%代森錳鋅，斜率k在0.666 9～0.829 7之間，是供試藥劑中斜率k較小的，說明西瓜炭疽病菌對這2種藥劑的敏感性較低。

2.2 9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌分生孢子萌發的影響

各藥劑供試濃度、毒力回歸方程、相關系數r和EC50結果見表2。

根據分生孢子萌發抑制法測定的EC50結果(表2)表明，供試9種殺菌劑基本歸為4類：95%嘧菌酯、97%咪鮮胺和97%甲基硫菌靈，EC50分別是0.069 4、0.090 7和0.167 2，大于其他藥劑的EC50，說明這3種藥劑抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、80%代森錳鋅，EC50介于1.853 0～9.503 9 mg/L之間，是供試藥劑中EC50較小的，說明這3種藥劑抑菌效果較好；95%戊菌唑的EC50為14.830 3 mg/L，說明該藥劑抑菌效果一般；95%惡霉靈的EC50為79.271 1 mg/L，抑菌效果較差，98%多菌靈的EC50為99.335 3 mg/L，說明該藥劑抑菌效果最差。

表2 供試9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌分生孢子萌發的抑制作用Table 2 Toxicity of nine fungicides on spores germination of C.orbiculare

回歸方程的斜率與殺菌劑對病菌的敏感性成正比。按回歸方程的斜率k，供試藥劑可以分為2類：95%惡霉靈、95%戊菌唑、98%多菌靈、95%嘧菌酯、95%烯肟菌酯、97%咪鮮胺和80%代森錳鋅，斜率k在1.219 1～1.573 2之間，大于其他供試藥劑的斜率k，說明西瓜炭疽病菌對這7種藥劑的敏感性較高；97%甲基硫菌靈、98%百菌清，斜率k在0.894 4～0.917 5之間，是供試藥劑中斜率k較小的，說明西瓜炭疽病菌對這2種藥劑的敏感性較低。

2.3 殺菌劑嘧菌酯和咪鮮胺混配聯合毒力測定

由表3可知，95%嘧菌酯與97%咪鮮胺以 4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4的比例混配對西瓜炭疽病菌的EC50分別為0.075 7、0.043 3、0.103 9、0.107 1和0.105 9 mg/L，均表現出了顯著的抑菌作用。同時，95%嘧菌酯與97%咪鮮胺的4∶1和2∶1混配劑的EC50均小于95%嘧菌酯單劑和97%咪鮮胺單劑的EC50，表明這兩種比例混配劑對西瓜炭疽病病菌的抑制效果明顯好于單劑。95%嘧菌酯與97%咪鮮胺的4∶1和2∶1兩種混配劑的SR，分別為1.268 2和2.260 0，前者介于0.5和1.5之間，表示加和作用，后者SR大于1.5，表明比例為2∶1的混配表現為增效作用。其余4種混配比例的SR均介于0.5和1.5之間，均為加和作用。

3 結論與討論

菌絲生長速率抑制法的毒力測定結果表明，9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的EC50大小順序為：嘧菌酯>咪鮮胺>甲基硫菌靈>百菌清>烯肟菌酯>戊菌唑>代森錳鋅>惡霉靈>多菌靈，其中嘧菌酯對菌絲生長抑制作用最強，EC50為0.093 3 mg/L；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的抑制作用較好；多菌靈的抑制作用最弱，EC50為99.335 3 mg/L。分生孢子萌發法的毒力測定結果表明，9種藥劑對西瓜炭疽病菌的EC50大小順序為：嘧菌酯>咪鮮胺>甲基硫菌靈>百菌清>烯肟菌酯>代森錳鋅>戊菌唑>惡霉靈>多菌靈，其中嘧菌酯對分生孢子萌發的毒力最強，EC50為0.069 4 mg/L；百菌清、烯肟菌酯、代森錳鋅毒力次之；多菌靈的EC50為99.335 3 mg/L，毒力最小。嘧菌酯和咪鮮胺為毒力最高的2種藥劑，這與周文靜等[14]的研究結果相一致，與付余波等[15]報道的梨炭疽病菌的毒力測定相吻合。在本試驗中，采用聯合毒力測定得出當嘧菌酯與咪鮮胺以2∶1的比例混配時表現為增效作用。

表3 嘧菌酯與咪鮮胺混配對西瓜炭疽病菌菌絲生長的抑制作用Table 3 Toxicity of azoxystrobin and prochloraz mixed on mycelium growth of C. orbiculare

同一殺菌劑對病菌菌絲生長和孢子萌發的抑制作用可存在差異，戊菌唑對菌絲生長抑制作用較強，但對孢子萌發抑制作用較弱，故可在發病的初期使用；而代森錳鋅對孢子萌發抑制作用較強，對菌絲生長抑制作用較弱，故可在發病前噴施,預防病菌孢子的初侵染，并可在發病期噴施，防止孢子再侵染，與王春明等[9]報道結果較為一致。

不同殺菌劑敏感性測定中斜率越大說明病菌對藥劑的反應靈敏度越高，即隨著質量濃度的增加，抑菌率明顯增大[16]。西瓜炭疽病菌的菌絲生長對咪鮮胺的敏感性最高，孢子萌發對代森錳鋅和咪鮮胺的敏感性最高。

多菌靈是苯并咪唑類殺菌劑，若長期使用，易產生抗藥性[17]，試驗中多菌靈對該菌的毒力最差，從而推測西瓜炭疽病菌對多菌靈已產生了一定的抗藥性，這可能與當地田間多菌靈使用量和噴藥次數過多相關，此結果與多菌靈的藥理相符合。葡萄、香蕉、蘋果等植物上的膠孢炭疽病菌也出現類似的不同程度敏感性降低的情況[18-20]，與本試驗結果相吻合。因此，應對多菌靈的抗藥性給予高度的重視，及早采取相應措施，例如輪換使用不同作用機制的殺菌劑，合理適量用藥，并進一步研究炭疽菌對多菌靈的抗藥性機理，避免抗藥性加重。

室內藥劑毒力測定結果雖可看出藥劑對菌絲和孢子萌發具有很好的抑制效果，為農業生產上防治該病提供了理論依據。但由于受很多因素的影響，藥劑在培養皿內的抑菌活性和在田間植物上的作用效果不一定完全一致，因此還有待做進一步田間的防治效果試驗。

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ToxicitydeterminationandproportioningtestsofninefungicidestoColletotrichumorbiculare

Tang Shuangshuang1, Liu Zhiheng1, Yu Zhaoge1, Zhao Tingchang2

(1.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China;2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The effects of nine fungicides and their mixtures onColletotrichumorbicularewere tested with the mycelium growth rate and spores germination methods in vitro in laboratory. The results showed that azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had significant inhibition activity on mycelium growth, with the EC50values ranged from 0.093 3 to 0.118 2 mg/L. Chlorothalonil, enestroburin and penconazole were less effective, with EC50values between 2.310 1 and 5.925 9 mg/L. Mancozeb, hymexazol and carbendazim were least effective, with EC50values of 36.876 3, 74.466 6 and 99.898 5 mg/L, respectively. Azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had the best inhibitory actions on the spore germination, with the EC50values of 0.069 4-0.167 2 mg/L. Chlorothalonil， enestroburin and mancozeb had less effects(with EC50of 1.853 0-9.503 9 mg/L), while carbendazim(with EC50of 99.335 3 mg/L) took the last place. Synergistic inhibition on mycelium growth was obtained when azoxystrobin and prochloraz were mixed.

Colletotrichumorbiculare; fungicides; toxicity determination; mixture

2013-12-11

：2014-01-11

國家西甜瓜產業技術體系(CARS-26)

S 481.9

：BDOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.033

* 通信作者 E-mail:805141919@qq.com