綠僵菌Ma55抗多菌靈突變株的誘變及抑菌作用研究

齊永霞， 陳方新， 丁 婷

(安徽農業大學植物保護學院,合肥 230036)

綠僵菌Ma55抗多菌靈突變株的誘變及抑菌作用研究

齊永霞， 陳方新*， 丁 婷

(安徽農業大學植物保護學院,合肥 230036)

在室內條件下測定了供試綠僵菌對多菌靈的抗性。結果表明，供試菌株對多菌靈均表現為敏感，其中，Ma55菌株對多菌靈最敏感。采用分生孢子定向篩選的方法獲得了金龜子綠僵菌抗多菌靈突變株，測定了抗性突變株對多菌靈的抗性差異。結果顯示，在獲得的抗性突變株中，MC-2的EC50最大，達到397.064 3 μg/mL，對多菌靈的抗性水平最高，抗性水平指數達到102.35。對Ma55抗多菌靈突變株的菌絲生長速率、產孢量及對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌的抑制效果的研究結果表明，抗性突變株的菌絲生長速率均比親本菌株Ma55小，但產孢量均比Ma55大，其中，MC-2的產孢量最大，為5.12×106個/mL；MC-5次之，其產孢量為4.81×106個/mL，MC-8的產孢量在抗性突變株中最低。平板對峙培養結果顯示，金龜子綠僵菌抗多菌靈突變株對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌菌絲生長的抑制作用均達到顯著水平，其中，MC-2對棉花枯萎病菌、棉花紅腐病菌菌絲生長的抑制作用最強，與親本對照菌株Ma55差異不顯著。

金龜子綠僵菌； 多菌靈； 抗性水平； 菌絲生長速率； 產孢量

綠僵菌[Metarhizium(Metsch.)Sorokin]是用來防治農林害蟲最常見的致病真菌之一[1-2]，特別是在防治土棲害蟲方面有著獨特的效果，其寄主昆蟲廣泛，達200種以上[3-6]。由于綠僵菌易于人工培養和商品化生產，有較好的貯藏性能，對環境較安全等優點，現在中國、美國、巴西、澳大利亞、墨西哥和日本等國均有綠僵菌商品制劑，主要用于防治沫蟬、蚊子、葉螨、蝗蟲等[7-12]。在國內，用綠僵菌對天牛、梨星毛蟲、菜青蟲、蠹蟲、蚊子等多種農林害蟲進行了防治試驗研究，均取得了良好的效果[13-16]。徐良雄等[17-18]從綠僵菌SC0924菌株發酵產物中分離獲得多種化合物，發現其中多種酚酸類化合物對荔枝霜疫霉菌具有很好的抑菌活性。這說明綠僵菌不僅在農、林、衛生害蟲防治上具有重要的作用，在植物病害的防治方面也具有潛在的應用價值。

自20世紀60年代以來，已有50多種綠僵菌制劑產品被研制出來并獲得登記[19]。然而，目前生產上使用的制劑多為孢子活菌制劑，在施用過程中常受到真菌殺菌劑的干擾。以多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑是一類重要的化學殺菌劑，因其內吸性強、毒性低、殺菌譜廣等特點，在田間得到廣泛應用。因此，金龜子綠僵菌在田間應用時容易受到該類廣譜性殺菌劑的干擾[20]。本研究在測定金龜子綠僵菌對多菌靈敏感性的基礎上，通過分生孢子定向篩選的方法對Ma55菌株進行了抗藥性誘變，得到抗多菌靈突變株8株，研究了抗性菌株在菌絲生長速率、產孢量、抗多菌靈穩定性及對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌的拮抗作用，對進一步研究金龜子綠僵菌在植物根際的定殖能力及豐富土傳植物病害的生物防治資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

金龜子綠僵菌[M.anisopliae(Metsch.)Sorokin](編號分別為Ma9、Ma10、Ma27和Ma55)，由安徽農業大學微生物防治重點實驗室保存；棉花枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Snyder & Hansen]和棉花紅腐病菌(F.moniliformeSheld.)由安徽農業大學植保學院植病教研室提供。

1.1.2 供試藥劑

97%多菌靈(carbendazim)原藥，江蘇省江陰農藥廠生產。先用滅菌蒸餾水配制成5 000 μg/mL的母液備用。

1.1.3 供試培養基

SDAY培養基[21]：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，酵母10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，自然pH。

PDA培養基[22]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水 1 000 mL，自然pH。

1.2 試驗方法

1.2.1 金龜子綠僵菌對多菌靈的敏感性測定

用菌絲生長速率法測定金龜子綠僵菌對多菌靈的敏感性。將金龜子綠僵菌各供試菌株分別轉接到SDAY培養基平板上活化，收集其分生孢子并配成一定濃度的分生孢子懸浮液，取200 μL分生孢子懸浮液均勻涂布于SDAY培養基平板上，放置于25 ℃的光照培養箱中培養3 d后，用直徑6 mm的打孔器沿其菌落邊緣打取菌碟，將菌碟分別移接到含多菌靈0.05、0.1、0.25、0.5、1、5、10.0和25 μg/mL的SDAY培養基平板上，以不加藥劑的處理為空白對照，每個處理重復4次。試驗重復3次。3 d后用十字交叉法逐日測量菌落直徑，通過菌絲生長抑制幾率值與多菌靈濃度對數之間的線性回歸分析，計算各菌株對多菌靈的EC50值。按下列公式計算菌絲生長抑制率；

菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值-6.0；

菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

1.2.2 抗多菌靈突變株的定向篩選

參照文獻[23]的方法，根據金龜子綠僵菌對多菌靈的敏感性測定結果，選擇EC50最小的Ma55菌株作為試驗用菌株，待Ma55菌株大量產孢后，配制Ma55分生孢子懸浮液。取100 μL Ma55分生孢子懸浮液均勻涂布在含多菌靈質量濃度為10 μg/mL的SDAY平板上，并用封口膜封口。1周后每隔2 d觀察1次，14～21 d后可見含藥平板上有單菌落出現，選取生長良好的單菌落，移至不含藥的SDAY平板上，待其產孢后，制成孢子懸浮液，吸取100 μL孢子懸浮液均勻涂布在含下一高濃度多菌靈的SDAY平板上，依次類推。試驗最后篩選出耐多菌靈200 μg/mL的突變體菌株，分別記為MC-1、MC-2、MC-3、MC-4、MC-5、MC-6、MC-7和MC-8。

1.2.3 抗多菌靈突變株的抗性水平測定

將8株突變株MC-1～MC-8，用直徑6 mm的打孔器打取菌落邊緣菌塊，移接到含多菌靈濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00 和25.00 μg/mL的SDAY培養基上培養。以不加藥劑的處理為對照，每處理4次重復。重復3次試驗。1周后用十字交叉法測量各抗性突變株的菌落直徑，并在此基礎上通過菌絲生長抑制幾率值與多菌靈濃度對數之間的線性回歸分析，計算各抗性菌株的EC50。根據以下公式計算抗性水平：

抗性水平=抗性菌株的EC50/敏感菌株的EC50。

1.2.4 抗多菌靈突變株的菌絲生長速率測定

將8株抗多菌靈突變株和親本敏感菌株Ma55活化后，用打孔器打取菌落邊緣菌塊，移接到SDAY平板上，每個處理重復3次，25 ℃恒溫培養3 d后，逐日測量各菌株的菌落直徑，并計算菌株的菌絲日均生長速率。菌絲日均生長速率計算公式為：

菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值-6.0；

菌絲日均生長速率(mm/d)=菌落直徑(mm)/生長時間(d)。

1.2.5 抗性突變株的產孢能力研究

待1.2.4中的菌落生長至第15天時，用0.05%的吐溫-80水溶液洗下各菌株的分生孢子，并用血球計數板計數，每處理重復3次。

1.2.6 抗多菌靈突變株的穩定性研究

將8株抗多菌靈突變株和親本敏感菌株Ma55繼代培養12代后，再移接到含多菌靈200 μg/mL的SDAY培養基上培養，每處理重復3次，1周后測量各菌株的菌落直徑，第15天時測量產孢量，根據菌落直徑及產孢量初步了解抗多菌靈突變株對多菌靈抗性的遺傳穩定性。

1.2.7 抗性突變株對棉花枯萎病菌和紅腐病菌的拮抗作用

采用平板對峙培養法，將金龜子綠僵菌抗性突變株和親本菌株Ma55轉接到SDAY平板上活化后，用直徑6 mm的打孔器沿其菌落邊緣打取菌碟，將病原菌菌碟接種于PDA平板的中間，金龜子綠僵菌抗性突變株和Ma55菌株分別接種于PDA平板上相距病原菌菌碟約4 cm處，同時設只接種金龜子綠僵菌和病原菌的平板為對照，各處理重復3次，每天觀察并記載金龜子綠僵菌和病原菌的菌落相向半徑。按下列公式計算菌絲生長抑制率：

菌落半徑(mm)=測量菌落半徑平均值-3.0；

菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100。

1.2.8 統計分析

數據處理及分析軟件采用DPS v7.05版和Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 綠僵菌對多菌靈的敏感性差異

以金龜子綠僵菌Ma9、Ma10、Ma27和Ma55菌株為供試菌株，測定了金龜子綠僵菌對多菌靈的敏感性。方差分析結果(表1)表明，多菌靈對供試4株金龜子綠僵菌菌株的EC50差異顯著，其中，Ma55菌株的EC50最小，對多菌靈的敏感性最強，其次是Ma27菌株，Ma10菌株的EC50最高，為4.051 2 μg/mL。此外，試驗過程中還發現，在含有10 μg/mL多菌靈的SDAY培養基上，各供試菌株的生長非常微弱，在含25 μg/mL多菌靈的SDAY平板上，供試菌株完全被抑制。

表1 供試菌株對多菌靈的敏感性1)Table 1 Sensitivity of the strains ofM.anisopliae to carbendazim

1) 表中同列數據后不同的小寫字母表示菌株之間差異顯著，且達到95%的置信度(Duncan多重比較法),下表同。
The different lowercase letters in the same column show significant difference among strains at 95% confidence level using the Duncan’s multiple comparisons, same as in the following tables.

2.2 Ma55不同抗性突變株對多菌靈的抗性水平

測定了8株Ma55抗多菌靈突變株對多菌靈的抗性水平。結果顯示(表2)，在抗性突變株中，MC-2菌株的EC50最大，為397.064 3 μg/mL；其次是MC-8菌株，EC50為222.772 1 μg/mL；MC-4菌株的EC50最小，為149.544 0 μg/mL。計算了各抗性突變株對多菌靈的抗性水平，發現MC-2菌株的抗性水平最高，達到102.35，其次是MC-8菌株，MC-4菌株的抗性水平最低。

表2 Ma55抗多菌靈突變株對多菌靈的敏感性Table 2 Sensitivity of the carbendazim-resistant isolates of Ma55 to carbendazim

2.3 Ma55抗性突變株的菌絲生長速率

菌絲生長速率測定結果(表3)表明，定向篩選獲得的8株Ma55抗多菌靈突變株的菌絲生長速率與親本菌株Ma55存在顯著性差異，親本菌株Ma55的菌絲平均生長速率最大，達到1.57 mm/d; MC-8次之，達到1.37 mm/d，MC-2菌株的平均生長速率最小，為1.27 mm/d。

表3 Ma55不同抗性突變株的菌絲生長速率和產孢量Table 3 Mycelia growth rates and conidia productionof the carbendazim-resistant isolates of Ma55

2.4 Ma55抗性突變株的產孢能力

由表3可以看出，Ma55抗多菌靈突變株的分生孢子產生能力均比Ma55菌株強，但不同抗性突變株間的產孢量存在顯著差異。在抗性突變株中，MC-2菌株的產孢量最大，其產孢量為5.12×106個/mL，其次是MC-5菌株，其產孢量為4.81×106個/mL，MC-8菌株的產孢量在抗性菌株中最低。

2.5 Ma55抗多菌靈突變株的抗藥穩定性研究

將8株抗多菌靈突變株繼代培養12代后，再移接到含多菌靈濃度為200 μg/mL的SDAY培養基上培養，Ma55抗多菌靈突變株均能正常生長和產孢。由表4可以看出，在抗性突變株中，除了MC-2菌株外，其他菌株第2代和第12代的菌落直徑及產孢量在5 %的水平上差異性顯著。結果顯示MC-2菌株的抗藥性較為持久和穩定。

表4 抗多菌靈菌株在含多菌靈200 μg/mL培養基上的菌落直徑(7 d)1)Table 4 Colony diameters of carbendazim-resistant mutant strains on the medium containing 200 μg/mL of carbendazim

1) 同行數據后小寫字母表示處理間的差異性(95%的置信度)(Duncan多重比較法)。
Data in the same row followed by the different lowercase letters are significantly different at 95% confidence level by Duncan’s multiple comparisons.

2.6 Ma55抗多菌靈突變株對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌的拮抗作用

平板對峙培養結果表明(表5)，Ma55抗性突變株對供試的棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌均具有較好的抑菌活性。由表5可以看出，8株抗多菌靈突變株對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌菌絲生長的抑制作用均達到顯著水平，MC-2菌株對棉花枯萎病菌、棉花紅腐病菌菌絲生長的抑制作用最強，與親本對照菌株Ma55差異不顯著；其次是MC-8菌株，MC-4菌株對兩種供試植物病原真菌的抑制作用相對較差。

表5 Ma55抗多菌靈突變株對棉花紅腐病菌和棉花枯萎病菌菌絲生長的抑制效果1)Table 5 Inhibitory rates of the carbendazim-resistantisolates of Ma55 against F.oxysporum f.sp.vasinfectum and F. moniliforme

1) 同列數據后小寫字母表示處理間的差異性(95%的置信度)(Duncan多重比較法)。
The different lowercase letters in the same column show significant difference at 95% confidence level by Duncan’s multiple comparisons.

3 討論

自20世紀60年代以來，人們逐漸認識到化學藥劑對生態環境的破壞性以及殘留污染對人類自身健康的影響，便開始努力發展有效的替代防治方法，以利植物保護的可持續發展[24]。生物防治由于克服了化學防治的上述弊端，一直受到人們的廣泛關注，且研究和實踐已證明其對部分有害生物的防治確實經濟有效，因而越來越受到人們的重視。但在植物有害生物的綜合治理過程中，經常會遇到需要同時或先后使用生物農藥和化學殺蟲劑、殺菌劑，以提高防效，降低作物產量和品質損失。

目前生產上應用綠僵菌等蟲生真菌防治馬尾松毛蟲、玉米螟和水稻葉蟬等，均取得良好的防治效果。然而，該類蟲生真菌主要以分生孢子作為害蟲的感染源，在實際生產應用時常受到很多外界環境因素的影響，其中包括化學農藥，許多化學殺蟲劑與殺菌劑對蟲生真菌會造成一定程度的負面影響，特別是殺菌劑的影響更為明顯[25-27]。張英財等[28]測定了18種常用低毒化學農藥對綠僵菌孢子萌發、菌絲生長及產孢量的影響，結果發現多菌靈、代森錳鋅和甲基硫菌靈對綠僵菌的毒害作用極強，即使在低濃度下也完全抑制孢子萌發和菌絲生長。徐金柱等[29]研究了波爾多液、多菌靈、三唑酮、甲基硫菌靈等6種化學殺菌劑對金龜子綠僵菌Ma83孢子萌發的影響，結果表明，除保護劑波爾多液外，供試的其他幾種殺菌劑對孢子萌發均具有極強的抑制作用，甲霜靈、百菌清和甲基硫菌靈對孢子萌發的抑制率在24 h時均達到100%。因此，人們在篩選強致病力殺蟲真菌菌株的同時，還應開展其制劑與化學藥劑相容性的研究，盡量提高蟲生真菌制劑的田間防治效果。另外，開展化學農藥與殺蟲真菌相容性研究并不僅僅是為了保證菌劑在田間充分發揮殺蟲作用，避免與不相容的化學農藥接觸，更為重要的是對開發菌藥復配劑，提高病蟲害的防治效果具有重要的指導意義。本研究在實驗室條件下測定了金龜子綠僵菌不同菌株對多菌靈的敏感性，結果顯示，多菌靈對供試的綠僵菌EC50分布范圍是3.879 6～4.051 2 μg/mL，對多菌靈均表現為敏感，而多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑作為一類廣譜性殺菌劑在田間被廣泛使用。因此，在田間有多菌靈存在的情況下，若綠僵菌與該類藥劑直接接觸，綠僵菌的生長必然會受到不同程度的干擾，從而進一步影響其對病蟲害的防治效果。采用藥劑定向誘導和篩選的方法對綠僵菌進行抗藥性改良，篩選得到抗藥性強的突變株對更好地發揮綠僵菌對農林病蟲害的防治具有重要的意義。

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Studiesoninductionandinhibitoryeffectsofcarbendazim-resistantmutantsofMetarhiziumanisopliae

Qi Yongxia， Chen Fangxin， Ding Ting

(CollegeofPlantProtection,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)

The sensitivities ofMetarhiziumanisopliaeto carbendazim were determined by mycelia growth rate methodinvitro. The results showed that among the tested strains ofM.anisopliae, Ma55 was the most sensitive strain to carbendazim. The resistant levels of the carbendazim-resistant strains ofM.anisopliaewhich induced by conidia were determined. The results showed that the resistant level of MC-2 was the highest among the carbendazim-resistant strains. The value of EC50and the resistant level were 397.064 3 μg/mL and 102.35, respectively. The mycelia growth rate, conidia generation and inhibition effects onFusariumoxysporumf. sp.vasinfectumandF.moniliformeof the carbendazim-resistant strains were also studied. The results showed that the mycelium growth rate of each carbendazim-resistant strain was smaller than Ma55 strain(the parent strain), while the ability of conidia generation was stronger than that of Ma55. Among the carbendazim-resistant strains, the conidia generated by MC-2 strain were the most, MC-5 strain followed, and MC-8 strain was the last. The inhibitory effects of the carbendazim-resistant strains against the testedF.oxysporumf. sp.vasinfectumandF.moniliformewere significant by dual-cultured, and the inhibitory effects of MC-2 was the largest.

Metarhiziumanisopliae; carbendazim; resistance level; mycelia growth rate; sporulation

2013-12-02

：2014-04-01

安徽農業大學穩定和引進人才科研資助項目(2011)；國家自然科學基金(11008382)；安徽農業大學青年基金(2011-31)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.017

* 通信作者 E-mail:superpowercfx@163.com