腹主動脈阻斷術后合并膿毒癥大鼠腎臟損傷TNF-α的變化

朱?，帲鲋?，張 迪，夏文芳，鄒捍東，周青山

腹主動脈阻斷術后合并膿毒癥大鼠腎臟損傷TNF-α的變化

朱?，?，尹述洲2，張 迪1，夏文芳1，鄒捍東1，周青山1

(1. 武漢大學人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060；2. 上海交通大學醫(yī)學院蘇州九龍醫(yī)院，江蘇 蘇州 215021)

目的 觀察大鼠腹主動脈阻斷缺血再灌注術后合并膿毒癥時腎臟組織病理學改變及腎臟組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化。方法 SPF級Wistar大鼠32只隨機分為4組：假手術組(A組)，腹主動脈阻斷組(B組)，膿毒癥組(C組)及腹主動脈阻斷合并膿毒癥組(D組)。所有動物于再灌注后8 h處死。4%多聚甲醛灌注固定后取腎臟，采用HE染色光鏡下對各組腎臟進行組織形態(tài)學對比觀察，免疫組化法檢測腎臟組織中TNF-α的表達。結(jié)果 HE染色顯示A組無明顯病理改變，B組可見輕度損傷，C組較B組病理改變嚴重，D組最為嚴重。TNF-α表達平均總面積A、B、C、D組依次遞增，與A組比較，B、C、D組均顯著增加(P均<0.05)，但B組與C組無顯著性差異(P>0.05)；TNF-α表達平均積分光密度A、B、D、C組依次遞增，各組間有顯著性差異(P均<0.05)。結(jié)論 腹主動脈阻斷術后合并膿毒癥時急性腎損傷最為嚴重，TNF-α作為一種至關重要的前炎性因子發(fā)揮了重要作用；免疫紊亂和腎臟再灌注無復流，對腎臟TNF-α表達造成了復雜的影響。

腹主動脈阻斷；膿毒癥；腎損傷；腫瘤壞死因子-α

腹主動脈阻斷術(AAC)造成阻斷平面以下的多個臟器缺血，在動脈開放后，缺血臟器聚集的代謝產(chǎn)物及炎癥物質(zhì)可進入血液循環(huán)。這種缺血再灌注損傷不僅能夠引起缺血組織的損害，還能導致全身炎癥反應，損害遠處臟器如心、腎、肺等，進而造成多器官功能不全綜合征，甚至死亡[1]。嚴重的可發(fā)展為膿毒癥。膿毒癥是ICU常見的一種嚴重感染性疾病，來勢兇猛，病情進展迅速，病死率高。膿毒癥導致的多器官功能衰竭(包括急性腎損傷)病死率可達70%[2]。在膿毒癥患者中急性腎損傷是一種常見并發(fā)癥[3]。腎臟是缺血再灌注臟器損傷中最早、最易受累的器官之一。目前針對AAC后缺血再灌注損傷基礎上序貫發(fā)生的膿毒癥導致急性腎損傷的研究甚少。本研究在AAC導致缺血再灌注損傷合并內(nèi)毒素致膿毒癥模型的基礎上，觀察大鼠腎臟組織病理學改變及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的變化。

1 實驗資料

1.1 動物分組 SPF級Wistar大鼠32只(湖北省疾病控制中心實驗動物中心提供)，雄鼠27只，雌鼠5只，體質(zhì)量為(250±30)g。實驗前12 h予禁食，可自由飲水。將動物隨機分為4組(實際造模成功數(shù)目，每組8例)：假手術組(A組)，腹主動脈阻斷組(B組)，膿毒癥組(C組)，腹主動脈阻斷合并膿毒癥組(D組)。

1.2 模型制備 缺血再灌注損傷模型：以45 mg/kg戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，經(jīng)側(cè)腹切口，腹膜后分離出腹主動脈及左腎動脈，在靠近膈肌處，以無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈，夾閉即刻可見左腎立即由紅色轉(zhuǎn)為蒼白，20 min后可見有花斑狀改變，松開動脈夾顏色轉(zhuǎn)紅。膿毒癥模型：再灌注后2 h對應時間點經(jīng)腹腔注射脂多糖內(nèi)毒素20 mg/kg。所有動物以手術后存活8 h為造模成功標準。A組僅分離腹主動脈但不阻斷，不注射內(nèi)毒素，僅于相應時間點經(jīng)腹腔注射生理鹽水20 mg/kg；B組分離腹主動脈并阻斷，再灌注2 h后經(jīng)腹腔注射生理鹽水20 mg/kg；C組假手術后2 h經(jīng)腹腔注射內(nèi)毒素 20 mg/kg；D組腹主動脈阻斷再灌注2 h后，腹腔注射內(nèi)毒素 20 mg/kg。

1.3 主要試劑 脂多糖內(nèi)毒素，DAB顯色劑，多聚甲醛，左旋多聚賴氨酸(Sigma公司)，兔抗大鼠TNF-α抗體，SABC試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.4 檢測指標及方法 術后8 h，行腹腔麻醉，開胸放血，胸主動脈插管行灌注固定，左右腎各取一段，4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋。蘇木素-伊紅(HE)染色：常規(guī)脫蠟入水，取腎臟進行HE染色觀察腎臟組織病理學的損害。使用免疫組化觀察TNF-α表達的變化，對各組切片進行圖像采集，使用Image Program Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性表達平均總面積(Sum Area)和平均積分光密度(MIOD)，以棕黃色顆粒為陽性表達。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎臟組織病理學改變 A組腎小球形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，無毛細血管淤血表現(xiàn)；腎小囊囊腔充盈；腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，管腔通暢；間質(zhì)無明顯水腫及炎性細胞浸潤。見圖1。B組多數(shù)皮質(zhì)腎小球皺縮，毛細血管輕度淤血，紅細胞滲出，髓質(zhì)腎小球病理改變較輕微；皮質(zhì)腎小囊無明顯變化，髓質(zhì)腎小囊囊腔變窄；部分腎小管上皮細胞水腫變性，細胞扁平、脫落，排列稀疏、紊亂，管腔變窄，部分管腔內(nèi)可見少量細胞和蛋白管型，外髓質(zhì)及皮髓交界處、外髓內(nèi)帶的近端小管受損較為嚴重，主要表現(xiàn)為刷狀緣脫落；可見間質(zhì)輕度水腫，出血，炎癥細胞浸潤，以髓質(zhì)較為嚴重。見圖2。C組可見絕大部分腎小球皺縮，毛細血管淤血，紅細胞滲出；皮質(zhì)腎小囊與髓質(zhì)腎小囊均可見囊腔明顯變窄；腎小管上皮細胞腫脹、變性、壞死脫落，刷狀緣壞死脫落，管腔狹窄明顯，并可見大量細胞或蛋白管型形成；腎間質(zhì)廣泛水腫，出血，大量炎性細胞浸潤。見圖3。D組多數(shù)腎小球皺縮，毛細血管嚴重淤血，紅細胞滲出，但髓質(zhì)腎小球病理改變較B組更為嚴重，但較C組稍輕；皮質(zhì)腎小囊與髓質(zhì)腎小囊囊腔均明顯變窄；腎小管上皮細胞水腫變性明顯，刷狀緣脫落嚴重，管腔閉塞，內(nèi)可見大量細胞或蛋白管型形成；腎間質(zhì)嚴重水腫，出血，大量炎性細胞浸潤。見圖4。

圖1 A組大鼠腎臟組織病理學改變(HE，×400)

圖2 B組大鼠腎臟組織病理學改變(HE，×400)

圖3 C組大鼠腎臟組織病理學改變(HE，×400)

2.2 各組免疫組織化學腎臟組織TNF-α表達變化 A組少量腎小球及腎小管可見陽性染色，主要在腎小球及腎小管內(nèi)壁線狀表達，部分腎小管上皮細胞胞漿可見弱陽性染色；B、C、D各組均可見腎小球及腎小管內(nèi)壁線狀表達，部分腎小管因上皮細胞損害而無典型線性表達，但腎小管上皮細胞胞漿仍可見強陽性表達；B組腎小球表達增加，C組與D組更為明顯；所有陰性對照切片無陽性染色。TNF-α陽性表達總面積A、B、C、D 4組依次遞增，B組與C組無顯著性差異(P>0.05)，余各組比較均有顯著性差異(P均<0.05)。TNF-α表達面積積分光密度：A、B、D、C 4組依次遞增，各組比較均有顯著性差異(P均<0.05)。見表1。

圖4 D組大鼠腎臟組織病理學改變(HE，×400)

表1 4組腎臟TNF-α陽性表達總面積和MIOD比較

注：①與A組比較,P<0.05；②與B組比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05。

3 討 論

AAC造成阻斷平面以下的多個臟器缺血再灌注損傷，導致全身炎癥反應綜合征，損害遠端臟器，進而造成多器官功能不全綜合征，甚至導致死亡。嚴重膿毒癥是機體免疫系統(tǒng)與侵入病原體之間發(fā)生的不適當反應，是過度的炎癥反應和過度的凝血反應等而導致機體組織、器官損害的病理生理學狀態(tài)，并導致循環(huán)系統(tǒng)紊亂及其一系列的損害[4]。脂多糖內(nèi)毒素是目前已知的誘導白介素和腫瘤壞死因子的重要因子，與宿主免疫系統(tǒng)進一步相互作用后可激發(fā)細胞因子的釋放。有研究認為其中TNF-α可能起核心作用，它在炎癥反應中最早釋放，可進一步引起炎癥因子IL-6、IL-8、IL-11、IL-12及其他脂質(zhì)介素如白三烯、血栓素、血小板活化因子、前列腺素、補體等的釋放，進一步放大炎癥反應[5]。由此可見，在缺血再灌注損傷和膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展中，TNF-α均扮演了重要角色。

腎缺血再灌注損傷存在多種機制，包括小管細胞凋亡、氧自由基形成、線粒體功能衰竭、炎性細胞因子以及中性粒細胞扣押[6]。許多學者認為炎癥因子在缺血再灌注損傷中占據(jù)著重要的地位。有研究表明，腎臟缺血再灌注損傷后，腎組織TNF-α表達顯著提高[7]。另外，腎組織過量表達TNF-α可以引發(fā)顯著的細胞損傷及功能障礙[8]。腎臟TNF-α可以促進中性粒細胞浸潤以及缺血再灌注早期腎損傷的發(fā)生及發(fā)展[9]。TNF-α不僅是機體炎癥反應中激發(fā)細胞因子產(chǎn)生級聯(lián)反應的主要遞質(zhì)，也是導致創(chuàng)傷后機體免疫功能紊亂的重要因素之一，并且TNF-α能刺激其他幾種促炎性細胞因子如IL-1β、IL-6及IL-8等產(chǎn)生[10]。

Amanda等[11]研究顯示，腎臟缺血再灌注后(缺血60 min)，腎血流量顯著降低，最低至基礎值50%以下。Legrand 等[12]注射LPS制作膿毒癥模型發(fā)現(xiàn)，注射LPS后30 min，MAP下降至基礎值的65%，大約3 h后回升至接近基礎值，最后再次下降，在5 h降至基礎值的55%左右。顯然，腹主動脈阻斷和腹腔注射LPS均可導致腎臟缺血再灌注損傷。當腎臟缺血再灌注時，腎血流量可有一定程度的恢復，但是腎皮質(zhì)、皮髓結(jié)合處以及外髓的微循環(huán)并未完全恢復，亦即再灌注無復流現(xiàn)象。事實上腹主動脈阻斷亦可導致腸源性內(nèi)毒素血癥。在本實驗中，20 min的腹主動脈阻斷與腹腔注射20 mg/kg LPS所致的TNF-α表達在總面積上十分接近，但是平均積分光密度卻以后者為多。筆者推斷，20 min的腹主動脈阻斷以及再灌注，腎臟經(jīng)歷了一次缺血再灌注損傷，腎臟存在再灌注無復流，因而TNF-α可能更多地來自于腎臟本身扣押的巨噬細胞，而不是來自循環(huán)中，因為循環(huán)中的TNF-α無法進入或者很少進入無復流的腎組織；而假手術后腹腔注射20 mg/kg LPS，可以導致腎臟及循環(huán)中的TNF-α迅速增加；當腹主動脈阻斷術后2 h腹腔注射20 mg/kg LPS時，因為腹主動脈阻斷所致的缺血再灌注損傷，已經(jīng)消耗了大量的巨噬細胞，此時造血系統(tǒng)尚未產(chǎn)生足夠多新的巨噬細胞，故而免疫系統(tǒng)對LPS的反應不太明顯，這一點可以解釋為何雙重打擊組與腹主動脈阻斷組相比TNF-α表達面積增加，但平均光密度僅僅輕度增加，甚至低于假手術后腹腔注射20 mg/kg LPS所導致的TNF-α表達；盡管如此，AAC后2 h腹腔注射20 mg/kg LPS仍然加重了腎臟組織病理改變，增加了病死率。

AAC術后合并膿毒癥大鼠急性腎損傷最為嚴重，TNF-α作為一種至關重要的前炎性因子發(fā)揮了重要作用；免疫紊亂和腎臟再灌注無復流，對腎臟TNF-α表達造成了復雜的影響。筆者將在進一步對AAC術后序貫發(fā)生膿毒癥時，全身多臟器功能損傷及其損傷機制進行系統(tǒng)研究的基礎上，展開治療干預實驗，探尋有效的防治途徑。

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Changes of TNF-α in rats underwent kidney injury complicated with metastasizing septicemia infection after abdominal aorta clamping

Zhu Ruiyao1, Yin Shuzhou2, Zhang Di1, Xia Wenfang1, Zou Handong1, Zhou Qingshan1

(1.The People’s Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China; 2.Suzhou Jiulong Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Suzhou 215021, Jiangsu, China)

Objective It is to observe the pathmorphological changes of kidney tissues and the expression of TNF-α in kidney tissues of rats with ischemic reperfusion injury complicated with sepsis after abdominal aorta champing (AAC). Methods Thirty-two Wistar rats of SPF were randomly divided into four groups: control group (group A), abdominal aorta champing group (group B), sepsis group (group C), and abdominal aorta champing complicated with sepsis group (group D). All animals were killed 8 hours after the reperfusion. The pathomorphological changes in Kidney tissues were observed with HE method, and the TNF-α expression was detection by immunohistochemistty methods. Results There was no obviously pathological changes in group A, and was slight pathological changes in group B, the pathological changes in group C was more serious than group B, the pathological changes was most serious in group D. The expression area of TNF- α was increased from group A to D, the amount of group A was least among the four groups (allP<0.05), but there was no significant differences between group B and C (P>0.05); the average integral optical density of TNF- α was increased from group A to D, there were significant differences among the four groups (allP<0.05). Conclusion The kidney injury is worst in AAC complicated with sepsis, TNF- α play an important role as a vital pro-inflammatory cytokines; the expression of TNF- α is affected by the immunologic derangement and reperfusion.

abdominal aorta clamping; sepsis; kidney injury; tumor necrosis factor - α

朱?，帲?，住院醫(yī)師，主要從事危重病臟器保護研究。

江蘇省自然科學基金資助項目(BK2009139)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.004

R-332

A

1008-8849(2014)15-1606-04

2014-03-01