多發性骨髓瘤應用熒光原位雜交檢測基因異常的價值

李文兵,李顯東

(湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000)

多發性骨髓瘤應用熒光原位雜交檢測基因異常的價值

李文兵,李顯東

(湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000)

目的 探討應用熒光原位雜交檢測法檢測多發性骨髓瘤基因異常的價值，進一步分析臨床分期及免疫學分型特點。方法 選擇40例多發性骨髓瘤患者，對RB1、1q21、p53、D13S319以及IGH 5種基因行熒光原位雜交檢測，分析p53缺失、RB1缺失、1q21 擴增及IGH基因的重排發生情況，并統計處理基因異常與免疫學分型以及臨床分期的關系。結果 RB1、1q21、p53、D13S319及IGH 5種基因的陽性閾值分別為8.6%，7.2%，7.2%，7.9%和9.7%，40例患者中1q21 擴增23例(58%)，同時檢測出RB1缺失以及D13S319缺失14例(35%)，p53缺失9例(22%)，IGH基因重排15例(38%)。臨床D-S分期與IGH重排有顯著相關性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期與p53缺失有顯著相關性(r=-0.449，P=0.005)，免疫學分型與D13S319缺失有顯著相關性(r=-0.341，P=0.040)，其余幾種基因異常均無顯著相關性。結論 多發性骨髓瘤較為常見的基因異常主要為p53缺失、RB1 缺失、1q21 擴增及IGH基因的重排，應用熒光原位雜交檢測能夠較好地分析基因異常與多發性骨髓瘤的關聯性以及預后，值得臨床予以廣泛性推廣應用。

多發性骨髓瘤；熒光原位雜交；基因異常；檢測率

多發性骨髓瘤(MM)主要特征為骨髓克隆性漿細胞異常積累，同時伴隨有惡性增殖，在血液腫瘤中約占10%[1-2]，MM易出現基因異常，發生率較高，同時有獨立的預后判斷意義，臨床常用的傳統方法即細胞遺傳學檢測，其對基因異常的檢測率僅占患者的1/3[3-4]，而隨著醫學技術的發展，目前使用的熒光原位雜交檢測法，則可以全面對細胞進行分析，避免了傳統細胞遺傳學檢測的缺陷，提高了基因異常的檢測率。筆者對40例多發性骨髓瘤患者應用熒光原位雜交檢測，現將結果報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2012年3月—2013年12月本院收治的多發性骨髓瘤患者40例，其中男25例，女15例；年齡37～81(61.8±2.1)歲。多發性骨髓瘤的診斷依據2008年中國多發性骨髓瘤工作組制定的《中國多發性骨髓瘤診治指南》中相關標準[5]。臨床分期主要為ISS分期與DS分期，其中ISS分期中Ⅰ期 8 例，Ⅱ期16例，Ⅲ期16例；DS分期中Ⅰ期 7 例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例。免疫學分型IgG 型 21例，輕鏈型6例，不分泌型4例，IgA 型9例。選擇同期非血液系統惡性疾病患者16例作為對照組，其中男10例，女6例；年齡25～66(58.3±1.6)歲。2組患者在年齡、性別等基礎資料比較無顯著性差異(P均>0.05)。2組患者均簽署參與本試驗知情書，并經倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 探針 本文所用熒光原位雜交檢測試劑盒均出自北京金菩嘉生物公司，其中含有序列特異性探針 1q21，主要針對1q21 區帶，此外還含有序列特異性探針RB1即(視網膜神經膠質瘤基因)以及D13S319，主要針對13q14 區帶，還含有序列特異性探針IGH以及探針p53，分別針對14q32 區帶與17p13 區帶，對探針做好標記，并保存，保存溫度-20 ℃。

1.2.2 處理標本 將新鮮的骨髓均勻涂片，不要過厚，晾干后，行56 ℃烤片處理，處理時間為10～20 min，再應用100%的甲醇浸泡約5 min，使用濃度100%的乙酸浸泡處理30 min，室溫下使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，隨后老化玻片約60 min，或者在室溫下過夜老化玻片，老化好的玻片先后置入37 ℃的RNaseA溶液以及鹽酸胃酶溶液中，孵育時間分別為30 min與10 min，再行使用2×SSC液洗片2次，5 min/次，隨后在-20 ℃下依次置入到濃度分別為70%，100%和85%的乙醇中行梯度脫水，時間約2 min，晾干后加熱到56℃，行雜交試驗。

1.2.3 原位雜交 探針的配置要在暗室內依照檢測試劑盒的操作進行，在70 ℃下，應用濃度70%的甲酰胺變性6 min，隨后置入50 ℃環境下保存備用，行老化處理后的玻片可以放置在73 ℃下，使用70%的甲酰胺變性6 min，隨后在-20℃下依次置入到濃度分別為70%，100%和85%的乙醇中行梯度脫水，時間約3 min，晾干后，再置入50 ℃烤片機上行預熱處理約5 min，隨后可將經變性后的10 μL 探針滴加入雜交區，加蓋蓋玻片防止氣泡，在42 ℃下，密封后過夜，雜交后將玻片置于甲酰胺溶液，2×SSC溶液中洗滌后，于室溫下，置入濃度70%的乙醇中浸泡3 min，在晾干后行DAPI復染再行封片。

1.4 統計學處理 本研究所用統計學軟件為SPSS 17.0，對研究中的計數資料行2檢驗，使用Spearman相關系數分析。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 涉及探針的陽性閥值 16例非血液系統惡性疾病患者，其骨髓樣本間期核細胞各個探針陽性細胞表達率見表1。

表1 5種基因探針雜交信號陽性閥值 %

2.2 全部患者探針異常表達情況 經Spearman 相關分析，p53缺失與lq21 擴增呈正相關(r=0.356,P=0.034)；RB1缺失及D13S319缺失呈正相關(r=0.855，P=0.001)。見表2。

表2 5種基因探針雜交信號陽性閥值 例(%)

2.3 基因異常與免疫分型及分期情況 基因異常與免疫學分型及臨床分期關系，其中D-S分期與IGH重排有相關性(r=0.425，P=0.001)，ISS分期與p53缺失有相關性(r=-0.449，P=0.005)，免疫學分型與D13S319缺失有相關性(r=-0.341，P=0.040)。其余基因異常與ISS分期以及D-S分期無顯著相關性，且與免疫學分型無明顯相關性。

3 討 論

在早期研究中，對多發性骨髓瘤的分子細胞遺傳學以及細胞遺傳學分析，幾乎全部的多發性骨髓瘤均有克隆性基因異常[6-7]，多為復雜核型異常，最為常見的是1，13，14及17號染色體的數目或者結構異常。本研究中，分別選擇了5種特異性探針，為IGH、D13S319、p53、RB1以及1q21，檢測后得出異常表達率較高的RB1缺失、1q21擴增、p53缺失以及IGH重排。研究結果表明，多發性骨髓瘤患者，其RB1 缺失、1q21 擴增、D13S319 缺失、p53 缺失及IGH重排的檢出率分別為35.0%，57.5%，35.0%，22.5%和37.5%，其中1q21 擴增發生率最高，再者為p53 缺失，82.5%患者均存在基因異常，且復雜核型異常約占60%，因為應用傳統的細胞遺傳學檢測，結果顯陽性患者僅占1/3。因此使用熒光原位雜交檢測較傳統方法更加具備優勢，可以顯著提高核型異常的檢出率，同時證實多發性骨髓瘤的核型異常多數為復雜核型異常。

1q21區域存在與多發性骨髓瘤是聯系緊密的基因簇，其中主要包括IL-6受體基因，多發性骨髓瘤會因IL-6受累，而導致IL-6的數目基因量的效性大量增加，促使骨髓中的漿細胞增殖分泌出較多的β2-MG，預后以及生存期均較差[8-9]。此外，在1q21區域中還存在CKSlB 基因，其屬于Cks/Sucl 蛋白，可通過p27K-與Skp2的依賴與非依賴機制促使多發性骨髓瘤細胞有所增殖，其也成為了多發性骨髓瘤的預后不良因素。

劉珊珊等[10]報道1q21擴增的發生率為57.5%，與國外研究相比較高，但與國內的研究報道幾乎一致，可見國內多發性骨髓瘤患者的1q21擴增發生比率較高。

而RB1與D13S319是檢測13q14 缺失的主要相關部位，13q14 缺失也在多發性骨髓瘤中有著重要的作用，是反應生存期較短的一個重要指標，尤其是并血清β2-MG水平升高的患者，由結果表明，RB1缺失的檢出率為35%，但RB1缺失與1q21 擴增不具有正相關性，且研究發現，p53 缺失也并不是多發性骨髓瘤的特有基因異常，p53 缺失在多發性骨髓瘤的檢出率為22%，且與ISS分期呈現負相關性(r=-0.449，P=0.005)，由此可見，p53 缺失是多發性骨髓瘤中較少的繼發事件，多發生在ISS期，通過Spearman相關性分析，p53缺失與1q21 擴增呈正相關(r=0.356,P=0.034)，與相關報道幾乎一致[11]。可見p53缺失與1q21 擴增會共同參與到激活血管新生級聯反應，增加了骨髓微環境中的微循環血量，這也是造成多發性骨髓瘤發病的重要機制。

本研究D13S319缺失的檢出率是35%，與相關報道比較稍低[12]，證實了免疫學分型與D13S319缺失有相關性(r=-0.341，P=0.040)，而IGH檢出率為38%，其與臨床分期D-S分期呈現正相關(r=0.425，P=0.001)。在本研究中，D-S分期Ⅰ期多發性骨髓瘤患者，3/7的患者可表達IGH重排異常，由此說明IGH重排是多發性骨髓瘤基因異常的一個早期提示事件。

綜上所述，p53缺失、RB1 缺失、1q21 擴增及IGH基因的重排是多發性骨髓瘤常見的復雜核型異常，前三者是反應多發性骨髓瘤發展以及預后的不良因素，應用熒光原位雜交檢測是一種較好的方法，可作為評估多發性骨髓瘤的常規檢查方法，值得臨床予以大量推廣使用。

[1] 楊璐璐，聶玉，劉欣，等. 免疫組織化學聯合熒光原位雜交技術檢測多發性骨髓瘤分子細胞遺傳學異常[J/CD]. 中華臨床醫師雜志:電子版，2013，7(8):3345-3350

[2] 楊瑞芳，李春溟，陳麗娟，等. 熒光原位雜交技術檢測MM分子遺傳學改變及其意義[J]. 中華醫學遺傳學雜志，2010，27(5)：567-570

[3] 鐘山，余英豪，黃紅浪，等. 熒光原位雜交法對胃癌組織 HER2 基因狀態的檢測[J]. 世界華人消化雜志，2011，19(2):132-137

[4] 王迪，黃亮，張恒，等. FICTION 技術在檢測多發性骨髓瘤遺傳學異常中的應用[J]. 中華血液學雜志，2011，32(4)：226-230

[5] 唐元艷，梁艷，熊濤，等. 熒光原位雜交技術與常規染色體分析檢測骨髓增生異常綜合征患者+ 8和20q -異常[J]. 臨床薈萃，2012，27(9):761-763

[6] 周麗穎,賈嬋維,余蘭,等. 熒光原位雜交技術在染色體異常中的應用研究[J]. 中國優生與遺傳雜志,2010,1(4):46-47

[7] Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues in 2008: an overview[J]. Pathologica，2010，102(3):83-87

[8] 宋國新，李紅芬，李霄，等. 熒光原位雜交與免疫組織化學檢測胃癌組織中HER2基因及蛋白表達一致性[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2012，28(10):1094-1097

[9] Kawankar N，Rao Vundinti B. Cytogenetic abnormalities in myelodysplasticsyndrome: an overview[J]. Hematology，2011，16(3):131-138

[10] 劉姍姍，彭忠異. HER2 基因在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 實用癌癥雜志，2012，27(4):339-342

[11] Birerdinc A，Nohelty E，Marakhonov A，et al. Pro-apoptotic andantiproliferative activity of human KCNRG，a putative tumor suppressor in13q14 region[J]. Tumor Biol，2010，31(1)：33-45

[12] 胡林萍，葛菁，張麗艷，等. 用于熒光原位雜交技術的骨髓細胞制片方法研究[J]. 中國實驗血液學雜志，2012，20(2)：496-499

The value of detection of multiple myeloma using fluorescence in situ hybridization gene abnormality

Li Wenbing， Li Xiandong

(Taihe Hospital Afflicted to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to approach the value of detection by fluorescence in situ hybridization method for multiple myeloma gene abnormality, and further analyzes the characteristics of clinical staging and immunological classification.Methods 40 patients with multiple myeloma were selected to test 5 genes including RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH by fluorescence in situ hybridization, the information of p53 deletion, RB1deletion, amplification of 1q21 gene, and IGH rearrangement were analyzed, and the relationships of abnormal gene with immunological typing and clinical staging of contact were statistics.Results Positive values of RB1, 1q21, p53, D13S319 and IGH were 8.6%, 7.2%, 7.2%, 7.9% and 9.7%. Among 40 patients, 23 cases (58%) were amplified by 1q21, At the same time, detection showed that the deletions of RB1 and D13S319 in 14 cases (35%), 9 cases (22%) of p53 deletion, 15 cases (38%) of IGH gene rearrangement. There were significant correlation between clinical D-S stage and IGH rearrangement (r=0.425,P=0.001), ISS stage and p53 deletion (r=-0.449,P=0.005), immunological classification and D13S319 deletion (r=-0.341,P=0.040).Conclusion For multiple myeloma, the common genetic abnormalities are p53 deletion, RB1 deletion, 1q21 amplification and IGH gene rearrangement. The application of fluorescence in situ hybridization can preferably analyze gene abnormalities and multiple myeloma associated and prognosis, and is worthy of wide popularization and application to clinical.

multiple myeloma; fluorescence in situ hybridization; gene abnormality; detection rate

李文兵，男，主管技師，研究方向為臨床檢驗。

李顯東，QQ：564494691

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.010

R733.3

A

1008-8849(2014)15-1624-03

2013-12-30