匹伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注后炎性因子及氧化應激的影響

尤楊，戚國慶，夏岳，馮倩，張慶文，楊志瑜

論著·基礎

匹伐他汀預處理對大鼠心肌缺血再灌注后炎性因子及氧化應激的影響

尤楊，戚國慶，夏岳，馮倩，張慶文，楊志瑜

目的探討匹伐他汀預處理對大鼠急性心肌缺血再灌注后炎性因子及抗氧化物酶活性、心肌梗死面積的影響。方法成年雄性SD大鼠42只隨機分為假手術組(Sham組)、對照組(I/R組)及實驗組(Statin組)，每組14只。Sham組與I/R組術前給予生理鹽水2 ml/d灌胃4周，Statin組給予匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1，溶解成2 ml灌胃4周。術后檢測血清中白細胞介素-6(IL-6)、IL-26、腫瘤壞死因子(TNF)-α及磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)的水平，留取結扎線下部分心肌組織用黃嘌呤氧化酶法測心肌總超氧化物岐化酶(T-SOD)活性，用氯化三苯基四氮唑(TTC)、伊文氏藍(Evans blue)雙染色法測定各組心肌梗死面積及缺血區面積。結果與I/R組比較，Statin組心肌梗死面積(AN/AAR)明顯減少(P<0.01)；與Sham組相比，I/R組、Statin組的血清IL-6、IL-26、TNF-α及CK-MB含量顯著升高(P<0.01)，T-SOD含量下降(P<0.01)；與I/R組比較，Statin組IL-6、IL-26、TNF-α及CK-MB含量較低(P<0.05)，T-SOD含量較高(P<0.01)。結論匹伐他汀可有效抑制炎性介質釋放，提高機體抗氧化能力，減少心肌細胞壞死數量，減輕再灌注后心肌壞死程度，對預防缺血再灌注心肌損傷有積極作用。

心肌缺血再灌注損傷；匹伐他汀；炎性因子；心肌梗死面積；大鼠

心肌缺血是一種心肌供血供氧不足和代謝產物清除減少的臨床狀態，可由多種原因引起的冠狀動脈血流量降低所致。隨著多種再灌注治療手段的廣泛應用，心肌缺血的治療進入了再灌注時期，然而再灌注治療在拯救缺血心肌的同時,還可以引起心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)抑制劑，是目前臨床上廣泛應用的調脂藥物，在防治心肌缺血再灌注損傷的研究中顯示出不同時段、不同機制的心臟保護作用，其中強大的抗炎及抗氧化應激作用是目前的研究熱點。本實驗通過制作匹伐他汀預處理的大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察匹伐他汀的使用對MIRI后炎性因子白細胞介素(IL)-6、IL-26、腫瘤壞死因子(TNF-α)及總超氧化物岐化酶(T-SOD)水平的影響，測定心肌梗死面積的變化，進一步探討其潛在心肌保護機制，為他汀類藥物在干預MIRI的臨床應用上提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： 成年雄性清潔級SD大鼠，體質量(250±20)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：醫動字第04037，動物等級：無特定病原體動物。

1.1.2 主要試劑和藥物： IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附試劑盒(上海西唐生物技術公司)；IL-26 放免試劑盒(北京放射免疫研究所)；超氧化物歧化酶(T-SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)；BAC蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；伊文思藍(Evans blue，美國Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma公司)；匹伐他汀片劑(2 mg/片，日本興和株式會社)。

1.1.3 主要儀器： LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)；Centrifuge 5417R低溫離心機、UNICEL DXC800全自動生化分析儀(德國BECKMAN COULTER公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作： 參照文獻[1，2]的方法制作模型。經10%水合氯醛以3 ml/kg腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機(潮氣量1.5 ml/100 g，頻率80次/min，吸呼比為1.5∶1)。以針式電極插入實驗大鼠四肢皮下，尾端連接于心電圖相應的肢體導聯線上，以II導聯記錄，記錄正常心電圖(紙速100 mm/s,電壓20 mm/mV)作為對照。開胸，使左心耳與肺動脈圓錐之間的心大靜脈清晰可見，以此靜脈為標志，結扎冠狀動脈前降支(LAD)。先在結扎線下放一根1 mm的乳膠管，結扎過程中觀察心肌顏色變化，發現心肌發灰或顏色變深，視為此結扎松緊度適宜。將LAD結扎造成左室前壁心肌缺血30 min，然后松線再灌注120 min。模型制作成功標準：以結扎LAD后左室前壁局部缺血心肌立刻由鮮紅立即變深、發紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高≥0.2 mV，T波電壓進行性增高，或QRS波幅升高及時限增寬作為結扎成功標準；松開結扎線恢復冠脈血流，以缺血部位心肌顏色恢復，T波迅速回落、ST段驟降50%以上作為冠狀動脈成功再通標準。

1.2.2 動物分組： SD大鼠42只隨機分為3組。假手術組(Sham組，n=14)：生理鹽水2 ml/d灌胃4周，術中LAD下只穿線，不結扎；缺血再灌注組(I/R組，n=14)：生理鹽水2 ml/d灌胃4周，建立I/R模型；匹伐他汀組(Statin組，n=14)：建立I/R模型，匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1用生理鹽水溶解成2 ml，每天1次，灌胃4周。

1.3 觀測指標 (1)心肌梗死面積：各組隨機抽取7只大鼠于實驗結束時間點再次原位結扎LAD，左室內推注5%伊文思藍(Evans blue)溶液1 ml，確定缺血區(無藍色)和非缺血區(藍色)，待大鼠口唇藍紫后速取左心室，垂直心室長軸切除心尖端3 mm厚心肌，其余心肌組織置-20℃冰箱冷凍30 min，然后自心尖向心底部垂直心室長軸切成2 mm厚切片4～5片，置1%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，在37℃恒溫水浴箱中避光孵浴10～15 min以區分缺血區及梗死區，以10%福爾馬林溶液固定24 h以增強染色顏色對比。以朝向心尖部的切面作為面積分析切面，藍色為正常心肌，淺紅色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌，通過計算機分析軟件測定梗死區面積(area of necrosis，AN)，以心臟總梗死區面積占總危險區面積(即缺血區與梗死區面積之和，area at risk，AAR)的百分比(AN/AAR)表示梗死面積，以危險區面積占左室面積(left ventricle，LV)的百分比(AAR/LV)表示危險區面積。(2)生化指標檢測： 其余7只大鼠于實驗結束時間點迅速開腹，下腔靜脈取血3 ml，其中1 ml加入促凝管,室溫靜置30 min后，以2 500 r/min轉速，離心8 min，吸取上層血清，-20℃冰箱中保存，用生化分析儀測定CK-MB含量；另外1 ml置入普通試管中,同上方法離心取血清, -20℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清 IL-6及TNF-α水平；剩余1 ml應用放射免疫法檢測IL-26水平，具體操作均按照試劑盒說明書進行；取血成功后立即垂直心室長軸切取結扎線以下所有心肌組織，液氮速凍后稱重，于-80℃冰箱中保存，以黃嘌呤氧化酶法測T-SOD活性。

2 結 果

2.1 心肌梗死面積的比較 I/R組、Statin組危險區面積(AAR/LV)差別無統計學意義(P>0.05)，即各組心肌缺血危險程度相似。與I/R組相比，Statin組梗死面積(AN/AAR)明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1 心肌梗死面積的比較

注：與I/R組比較，aP<0.01

2.2 血清生化指標及T-SOD含量比較 與Sham組相比，I/R組、Statin組的心肌T-SOD含量顯著降低(P<0.01)，Statin組T-SOD水平降低程度低于I/R組(P<0.01)。與Sham組比較，I/R組、Statin組的血清IL-6、IL-26、TNF-α及CK-MB升高(P<0.01)，Statin組IL-6、IL-26、TNF-α及CK-MB升高程度低于I/R組(P<0.05)。見表2。

3 討 論

目前急性心肌梗死的病死率及致殘率均較高，嚴重威脅人類的健康。限制和縮小梗死面積、改善預后的關鍵在于早期開通閉塞的冠狀動脈，迅速恢復缺血心肌的有效灌注。心肌再灌注治療的原則是盡早、最大程度、持久開通梗死相關冠狀動脈，恢復有效的心肌血流再灌注,挽救瀕死心肌,縮小梗死面積,抑制心室重構,以改善患者預后。但臨床上再灌注治療后?？梢姵霈F心律失常、心肌頓抑、心肌細胞死亡及與內皮細胞及微血管功能障礙相關的“無復流”現象。其原因目前多認為在心肌缺血時心肌細胞的凋亡增加，而在隨后的再灌注時，大量自由基的產生、鈣超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、細胞因子、血管內皮細胞損傷及中性粒細胞浸潤等起著重要作用。

3.1 他汀類藥物的多效性 他汀類藥物是目前臨床獲益最大的調脂藥物，其有效的降膽固醇作用，顯著降低了冠心病一級和二級預防中各類冠狀動脈事件的發生率以及二級預防中各種原因引起的死亡。不僅如此，他汀類藥物還具有獨立于降脂作用以外其他有益的作用，可以從不同途徑對心臟起到保護作用，稱之為他汀類藥物的多效性。其中包括：改善血管內皮功能、抗炎、抗氧化應激、抗血小板聚集和抑制血栓形成、抑制心臟電生理重構、調節心臟自主神經功能等[3～7]。最近研究還發現他汀類藥物能有效減輕再灌注損傷(MIRI)，其機制可能與其多效性密切相關[8～10]。

本實驗結果顯示經匹伐他汀處理組較單純缺血再灌注組炎性因子IL-6、IL-26、TNF-α水平升高程度減輕，T-SOD下降程度減輕，CK-MB水平顯著下降，心肌梗死面積減少，為匹伐他汀在心肌缺血再灌注損傷中的積極抗炎及抗氧化應激作用，從而減輕心肌損傷程度提供了有力證據。

3.2 IL-6、IL-26、TNF-α與MIRI的關系 在MIRI中,白細胞的作用在其病理改變中有十分重要的意義[11]。IL-6是被譽為白細胞介素家族“核心成員”的細胞因子,其與MIRI的機制有密切的關系，其靶細胞種類繁多，是參與機體多種系統及多個環節調節的重要細胞因子，對維持機體生理平衡，尤其是對免疫反應、炎性反應以及急性期反應具有十分重要的作用[12]。IL-26能誘導T 細胞活化增殖和分化, 誘導神經內分泌細胞產生激素，促進中性粒細胞分化；并可誘導ICAM-21表達, 通過改變內皮細胞滲透性影響白細胞遷移[13]。IL-26可作用于中性粒細胞, 促使中性粒細胞對心肌產生損傷。TNF是能直接造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，據細胞來源的不同可將其分為α、β 2個亞型。其中TNF-α主要與冠狀動脈動脈粥樣硬化的形成密切相關，其通過作用于血管內皮細胞促進血栓的形成。TNF可直接損傷血管內皮細胞，使其通透性增高，使血中膽固醇易于穿透內膜而在管壁內沉積，形成動脈粥樣斑塊；可促進原癌基因轉錄，產生血小板源性生長因子，破壞凝血—抗凝平衡，促進血栓形成；可刺激血管平滑肌細胞向血管內皮下浸潤、聚集和增生；可刺激血管平滑肌細胞產生一氧化氮合成酶，而一氧化氮合成酶增多，肌動蛋白合成減少，血管平滑肌細胞收縮較弱，細胞受損，內膜增厚，促進動脈粥樣硬化形成，加重心肌缺血。因此，TNF-α被認為是冠狀動脈內皮細胞功能紊亂、內膜增厚的始動因素[14]。

急性心肌梗死(AMI)發生后,白細胞向壞死灶浸潤,促進心肌組織的溶解吸收,誘導組織修復及瘢痕形成等一系列機體炎性及免疫反應，在浸潤過程中,各種細胞因子產生并釋放入血,進一步刺激血管內皮細胞及心肌細胞產生細胞因子,這些細胞因子作為炎性介質可單獨或協同促進心肌細胞的損害。近年來多項研究表明[15]，MIRI時，血管內皮細胞和中性粒細胞產生黏附分子,促使中性粒細胞向血管內皮細胞黏附并釋放顆粒狀彈性硬蛋白酶和活性氧,引起內皮細胞和細胞間基質等的組織損害。中性粒細胞進一步釋放另外的細胞因子,活化其他中性粒細胞等炎性細胞以及血管內皮細胞,使組織細胞的損害擴大。而IL-6、IL-26及TNF-α通過上述不同的作用均加重了MIRI時的心肌組織損傷。

表2 各組血清生化指標及心肌組織T-SOD含量比較

注：與Sham組比較，aP<0.01；與I/R組比較，bP<0.05

3.3 T-SOD與MIRI的關系 目前已有文獻報道，心肌缺血再灌注損傷時氧自由基的爆發是其重要的發病機制之一[16]。氧自由基是一類重要的細胞應激原，性質極不穩定，可造成生物膜結構破壞，細胞核分子變性等不良后果。正常情況下，體內過多的氧自由基(OFR)可不斷被抗氧化系統及時消除，機體隨時處于氧化—抗氧化的平衡狀態中。當組織細胞發生缺血、缺氧時，OFR清除功能降低或喪失，生成系統活躍，一旦再次恢復組織血流和氧的供給時，OFR便瞬間大量產生，并在體內急劇堆積，此時機體就處于氧化應激狀態。OFR通過攻擊組織內皮細胞膜脂質中的不飽和脂肪酸，使膜的結構和功能改變，膜流動性降低，通透性增加等；還可使Ca2+通道通透性增加，導致細胞內Ca2+超載，介導炎性物質產生 ，造成整個細胞結構與功能的損傷。OFR增加還直接抑制NO生成，導致血管內皮損傷，觸發細胞調亡[15]。而人體內存在完整的抗氧化系統來保持機體氧化—抗氧化平衡，其中，超氧化物歧化酶(SOD)就是最重要的抗氧化酶之一。SOD存在于細胞線粒體內，通過歧化作用使氧離子進一步轉化為水和氧氣，使機體維持正常生理功能，免受OFR損害。SOD 的活性可間接反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力[17]。研究顯示，SOD清除OFR的能力是有限的，如果過氧化物質產生過多，超過SOD的清除能力，就會使機體遭受OFR的氧化損傷[18]。本實驗成功建立大鼠I/R模型，定量檢測SOD含量，根據SOD可間接反映機體清除OFR的能力來評價匹伐他汀是否能使OFR清除增多，細胞受損程度減輕。本結果顯示匹伐他汀預處理能有效降低MIRI后CK-MB及血清IL-6、IL-26、TNF-α升高幅度，并使T-SOD下降程度減輕，有效減少了心肌梗死面積。故此結果表明匹伐他汀可有效保護缺血再灌注損傷的心肌，而此保護作用與抗炎及抗氧化應激作用有關，并顯示了早期使用匹伐他汀的預防治療價值[19，20]。

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Effectsofpitavastatinoninflammatoryfactorsandtheroleofoxidativestressinaratmodelofmyocardialischemia-reperfusion

YOUYang*,QIGuoqing,XIAYue,FENGQian,ZHANGQingwen,YANGZhiyu.

*TheThirdDepartmentofCardiovascularMedicine,TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo explore the effects of pitavastain on inflammatory factors(IL-6，IL-26，TNF-α)and T-SOD and cardiac infarct area in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion, which will provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia-reperfusion.MethodsA total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups: Sham group, control group(I/R group) and experimental group(Statin group). In Sham group and control group, 2ml saline were irrigated into stomach daily for 4 weeks, 0.42mg/kg pitavastain dissolved in 2ml saline were given in experimental group. In surgery,we weared line under the coronary artery without ligation in Sham group, and ligated the line for 30 minutes and then release it for 2 hours in I/R group and Statin group. The levels of IL-6，IL-26，TNF-α and CK-MB were discerned after operation.ResultsCompared with I/R group，Statin group significantly reduced infarct size(AN/AAR)(P<0.01).The levels of IL-6，IL-26，TNF-α and CK-MB in control group and experimental group elevated significantly compared with Sham group(P<0.01), but lower when comes to T-SOD content(P<0.05). The levels of IL-6,IL-26,TNF-α and CK-MB in I/R group were significantly higher than Statin group(P<0.05).ConclusionPitavastatin could inhibit the release of inflammatory mediators ang increase antioxidant capacity .It took a positive role in ischemia-reperfusion myocardial injury prevention.

Myocardial ischemia-reperfusion injury；Pitavastatin；Inflammatory factors；Cardiac infarct area；Rats

河北省科學技術研究與發展計劃(No.112761155)

050000 石家莊，河北醫科大學第一醫院心內3科(尤楊、戚國慶、夏岳、張慶文、楊志瑜)； 075000 張家口市 第一醫院心內3科(馮倩)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.018

2014-07-15)