雷帕霉素洗脫支架系統中雷帕霉素的含量測定

林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛華

(北京市醫療器械檢驗所，北京101111)

雷帕霉素洗脫支架系統中雷帕霉素的含量測定

林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛華

(北京市醫療器械檢驗所，北京101111)

目的：建立高效液相色譜法測定雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測定的方法并對樣品制備方法進行了驗證。方法：用waters 1525高效液相色譜儀進行檢測，色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶水(67∶15∶18)，流速1mL/min，紫外檢測器，檢測波長為280nm，外標法定量。結果：雷帕霉素的線性范圍為19.2～77.6μg/mL(r=0.9993)，檢出限為0.388μg/mL，平均加樣回收率為98.86%。結論：該方法簡便、快速、準確，可用于雷帕霉素洗脫支架系統中雷帕霉素的含量測定。

雷帕霉素洗脫支架；雷帕霉素；高效液相色譜法

0 引言

雷帕霉素又稱西羅莫司，是一種大環內酯類抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管內膜增生的作用。該藥物覆蓋于支架表面，可起到防止血管再狹窄的作用。目前雷帕霉素洗脫支架在國內臨床上應用已較為普遍，而雷帕霉素洗脫支架產品還沒有相應的國家標準或行業標準可做質量評價參考。文獻已有反相高效液相色譜法測定組織中或藥物中的雷帕霉素的含量，但尚無雷帕霉素洗脫支架產品中雷帕霉素含量測定方法，所以建立一種適用于雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測定的準確方法十分必要。本實驗旨在建立評價雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量的測定方法并對樣品的制備方法的有效性進行了驗證。

1 材料和方法

Waters高效液相色譜儀，配紫外檢測器(Waters公司)；電子天平(梅特勒-托利多公司)；雷帕霉素標準品(純度HPLC≥98%，北京北納創聯生物技術研究院)；甲醇(色譜純，Merck KGaA)；乙腈(色譜純，Mreda technology Inc)；實驗用水為去離子水。

(1)實驗條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇∶乙腈∶水= 67∶15∶18；流速：1mL/min；檢測波長：280nm。

(2)標準溶液的制備

精密稱取對照品9.7mg，加入乙腈溶解并定容至25mL，得到濃度為388μg/mL的對照品儲備液。取儲備液適量用乙腈逐級稀釋，得到濃度為19.2μg/mL、29.1μg/mL、38.8μg/mL、48.5μg/mL、58.2μg/mL和77.6μg/mL一系列標準溶液。

(3)樣品的制備

取支架1個，放入5mL棕色瓶中，精密加入5mL乙腈，靜置1h，超聲10min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液作為檢驗液。

2 結果

2.1 檢測波長的選擇

將配制好的雷帕霉素標準溶液用紫外分光光度計在190～700nm波長范圍內掃描，發現雷帕霉素在280nm處有最大的吸收峰，故選擇280nm作為檢測波長。波長掃描圖見圖1。

圖1 雷帕霉素標準溶液掃描圖

2.2 系統適應性試驗

取濃度為38.8μg/mL標準溶液一份，按“(1)”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果表明雷帕霉素及其異構體分離良好，雷帕霉素保留時間約為11min，理論塔板數大于3000，拖尾因子1.1；雷帕霉素異構體保留時間約為13.48min，理論塔板數大于5000，拖尾因子1.1，色譜圖見圖2。

圖2 標準溶液和樣品溶液色譜圖

2.3 線性范圍

取標準溶液按“(1)”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程為A=33722.8189C-130752.1；r=0.9993，該結果表明在19.2～77.6μg/mL范圍內線性關系良好。以響應值較低的雷帕霉素異構體計算檢出限，當稀釋對照品溶液濃度至0.388μg/mL時，其信噪比(S/N)等于4.0，故檢出限約為0.388μg/mL(S/N=4.0)。

2.4 重復性和穩定性試驗

取同一濃度標準溶液5份，按“(1)”項下的色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.91%(n=5)。

室溫放置0h、4h和8h后的同一標準溶液，按“(1)”項下的色譜條件連續進樣分析，記錄峰面積，計算雷帕霉素峰面積的RSD為1.3%。該結果表明雷帕霉素的乙腈溶液制備后室溫放置至少8h內穩定。

2.5 加樣回收率實驗

取已知濃度的樣品溶液9份，分別加入低、中、高三種濃度的標準溶液，每個濃度平行測試3份，按“(1)”項下的色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，低、中、高濃度的平均回收率分別為98.66%、99.18和98.73，總平均回收率為98.86%。

Table 1 Results of recovery test

2.7 樣品制備方法的確定和測定結果

1)取按“(3)”項下洗脫后的支架，置于新的容器中，加入2.5mL乙腈溶劑，并確保支架完全浸沒于溶劑中，超聲30min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液進樣測定，結果未發現雷帕霉素色譜峰。

2)取樣品，按“(3)”項下制備樣品，按“(1)”項下的色譜條件測定，按外標法計算檢驗液中雷帕霉素的含量，結果測得單個支架中雷帕霉素含量為141.04μg。

4 小結

(1)雷帕霉素在溶液中存在互變異構現象，異構體色譜峰與雷帕霉素色譜峰的相對保留時間約為1.2min，在計算雷帕霉素含量時可將色譜圖中的雷帕霉素峰和雷帕霉素異構體峰合并計算。

(2)單個雷帕霉素洗脫支架在5mL乙腈中靜置1h后，發現少量白色的涂層材料已被洗脫下來，故測定前需要過濾。洗脫后的支架再次超聲洗脫未發現雷帕霉素色譜峰，表明靜置1h后超聲10min的處理方法已能使支架中的雷帕霉素完全洗脫下來。

(3)本文建立了雷帕霉素洗脫支架高效液相色譜檢測方法，并對方法的有效性和樣品的制備方法進行了評價，結果顯示本方法具有靈敏、快速、方便之特性，可以滿足雷帕霉素洗脫支架含量測定的要求。

[1]陳宏林，尤慶生，孟小勇.HPLC法測定組織中雷帕霉素的含量[J].實用醫藥雜志，2008，25 (7) ：813-814.

[2] 任斌，黎曙霞，鄧斌等.高效液相色譜法測定西羅莫司血藥濃度[J] .中國藥學雜志，2004，39 (1) ：52-53.

[3] 魏靜，徐國旭，龔鎧等.雷帕霉素眼膏的制備及其含量測定[J].中國現代醫藥雜志，2010，12 (6) ：11-14.

[4] Philip Hughes，John Musser，Mary Conklin. The isolation，synthesis and characterization of an isomeric form of rapamycin[J]. Tetrahedron Letters，1992，33 (33) ：4739.

Determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent by HPLC

LIN Hong-sai, HUANG Yong-fu, LI Jian, YUE Wei-hua

(No.7, Xingguang 2nd Street, Opto-Mechatronics Industial Park, Tongzhou District, Beijing, China, 101111)

Objective:To establish a method for determination of rapamycin in rapamycin-eluting stent by HPLC with ultraviolet detection and verify the efficiency of sample preparation. Method: HPLC analysis of rapamycin was performed by a Waters 1525 chromatography equipped with a C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column and quantified by external standard method. The mobile phase was a mixture of methanol, acetonitrile and water (67∶15∶18) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was at 280nm.Result: The linear range of rapamycin was 19.2μg/mL～77.6μg/mL(r=0.9993).The limt detection was 0.388μg/mL and the average recovery was 98.86%. Conclusion: The method is simple, rapid and accurate for the content determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent.

rapamycin ; rapamycin -eluting stent;HPLC

2014-01-15

R972

A

1002-2376(2014)08-0007-03