進境木片松材線蟲PCR檢測方法研究

魏秋學，許美燕，繆愛斌，陳勁松，曾思海，呂國榮

(1.泉州出入境檢驗檢疫局 362000;2.漳州市疾病預防控制中心;3.南京出入境檢驗檢疫局)

隨著我國保護森林資源政策的實施，國內對原木、板材等資源性原料的需求量急劇增加，木片作為一種林木資源類造紙原料得到企業的廣泛關注。2009年10月，泉州口岸在全國首次以散裝船載方式進口造紙木片，至今進口量已超90萬t，并有逐步增加的趨勢。常規口岸線蟲檢疫首先需要從可疑病木樣中分離出線蟲，然后進行線蟲形態鑒定，一般耗時較長。筆者利用松材線蟲rDNA內轉錄區(ITS)特異性引物，對口岸入境木片攜帶的線蟲基因組DNA進行特異性PCR擴增，建立一套快速準確的線蟲檢測鑒定方法，并應用于口岸現場檢疫鑒定，提高口岸進境木片攜帶線蟲的鑒定速度和準確性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

引物特異性檢測采用的陽性松材線蟲樣本來源有2種，一種是從病木上分離并經鑒定為松材線蟲的樣本，另一種是南京農業大學實驗室繁殖保存的松材線蟲樣本。擬松材線蟲由南京農業大學實驗室提供，傘滑刃線蟲由本實驗室分離并經鑒定。檢測樣品為2012年7月至2013年12月泉州口岸入境的18批散裝木片。

1.2 引物對

供試引物對采用3對。其中1對 (BXF/BXR)為夏彥飛等［1］采用的引物，2對 (SCFa/SCRa、SCFb/SCRb)為運用BioEdit軟件比較GenBank中已公布的松材線蟲和其他松樹上寄生線蟲 (擬松材線蟲、傘滑刃線蟲等)的rDNA的保守序列差異，通過Primer premier 5.0軟件設計 (表1)。

1.3 引物特異性檢測

采用單條線蟲 PCR反應體系［2］。單條線蟲DNA的提取方法:在解剖鏡下，用移液器吸取1條線蟲于PCR反應管中，加入10 μL WLB裂解緩沖液［2.5 mmol/L DTT，1.125% Tween 20，0.25 g/L Gelatin，125 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris－ Cl(pH 8.3)，3.75 mmol/L MgCl2，2 uL蛋白酶K溶液 (600 mg/mL)］，加超純水使總體積為20 μL并混合均勻。迅速將混合液放置于－80℃冰箱，15 min后取出，用移液器將冰塊搗碎，再將其放置于PCR儀中，65℃孵育60 min，95℃孵育10 min使蟲體裂解，DNA釋放。裂解混合液14000 r/min離心3 min，上清液即為線蟲DNA溶液。DNA溶液置于－20℃保存或直接進行PCR反應。

表1 用于松材線蟲PCR檢測的供試引物對

PCR反應體系 (12.5 uL):0.7 μL 10×PCR緩沖液，0.6 μL 5 mmol MgC12，1 μL 2.5 mmol dNTPs，2.5 pmol/μL 的正反向引物各 1 μL，3.1 μL ddH2O，0.1 μL Taq 酶 (5 U/μL)，5 μL DNA模板。PCR反應條件為:94℃預變性5 min，40個循環的94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后72℃延長10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Marker為 100bp DNA Ladder。PCR反應所用的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、10×PCR緩沖液均購自寶生物工程 (大連)有限公司，100bp DNA Ladder Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 入境木片中松材線蟲的PCR檢測

松材線蟲檢測樣品DNA的提取方法:將木片用雙層紗布包裹，置于布氏漏斗上，漏斗下接一段乳膠管，用止水夾夾住乳膠管末端。在漏斗中加水浸沒木片，靜置12 h，打開止水夾放水約1.5 mL到培養皿中，即得線蟲液。將分離到的線蟲液裝入含有1 mL經65℃預熱的DNA提取液的5 mL離心管中。充分搖勻后，65℃水浴45 min，每8～10 min振蕩離心管幾次。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分搖勻后，4℃ 13000 r/min離心 10 min，移取上清液置于新離心管中，重復此步驟2～3次，直至分界面看不到白色沉淀物;加入等體積的異丙醇，先在室溫下放置20 min，接著置于－20℃ 20 min后，4℃ 13000 r/min離心 10 min，棄上清液;加入500 μL 70%乙醇洗滌，4℃ 13000 r/min離心10 min，去除乙醇，留取沉淀，空氣中干燥，然后加入20 μL TE緩沖液。

PCR 反應體系 (12.5 μL):1.25 μL 10 ×PCR緩沖 液，1 μL 25 mmol MgC12，1 μL 2.5 mmol dNTPs，2.5 pmol/μL 的正反向引物各 1 μL，6.15 μL ddH2O，0.1 μL Taq 酶 (5 U/μL)，1 μL DNA模板。PCR反應條件為:94℃預變性5 min，35個循環的94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后72℃延長10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Marker為100 bp DNA Ladder。PCR反應所用的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、10×PCR緩沖液均購自寶生物工程 (大連)有限公司，100bp DNA Ladder Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

利用3對引物分別對松材線蟲、擬松材線蟲和傘滑刃線蟲的基因組DNA進行PCR擴增檢測，以驗證引物特異性和檢測穩定性，結果表明:引物對BXF/BXR檢測特異性最高，能準確地檢測出松材線蟲，而擬松材線蟲、小桿線蟲、傘滑刃線蟲和其他腐生線蟲不能檢出，擴增的特征性條帶約為580 bp(圖1)，與預計的片段大小一致，從而驗證了引物對BXF/BXR對松材線蟲具有特異性。其他2對引物也能檢測出松材線蟲，但擴增的特征性條帶片段大小不穩定。因此，選定引物對BXF/BXR用于入境木片中松材線蟲的PCR檢測。

圖1 松材線蟲、擬松材線蟲和傘滑刃線蟲PCR檢測

2.2 入境木片中松材線蟲的PCR檢測

用松材線蟲特異性引物對BXF/BXR，以建立的PCR反應體系和反應條件對2012年7月至2013年12月泉州口岸入境的18批散裝木片進行了檢測，結果未檢出松材線蟲，結果與形態學鑒定結果一致 (圖2)。

圖2 入境木片松材線蟲PCR檢測

3 討論

目前，在口岸入境檢疫中，對線蟲的鑒定主要采用成蟲的形態學鑒定方法，但形態特征鑒定方法具有局限性。一是線蟲幼蟲的鑒定特征較少或沒有，當僅有幼蟲時，無法有效鑒定。二是線蟲近緣種之間的形態學特征存在重疊及變異現象，容易在鑒定時造成誤判現象，如松材線蟲與擬松材線蟲。［3］三是形態特征鑒定的對象是單一蟲體，當分離到的樣本量大時，在成千上萬只線蟲中尋找一只目標線蟲時具有相當大的難度，因此無法滿足口岸快速檢測的需要。

分子生物技術快速檢測是檢疫領域的發展趨勢［4］，其中 PCR 技術越來越多用于植物檢疫［5］。PCR即聚合酶鏈式反應，是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何特異性的目的DNA片段。采用特異性引物組合，可以實現對線蟲的準確、快速鑒定，且結果便于判讀，適合于口岸快速檢測，提高通關效率，為檢驗檢疫執法提供有力的技術支撐。

由于木片在浸泡過程中不可能分離到其所攜帶的所有線蟲，因此，采用PCR檢測方法未檢測到入境木片中攜帶有松材線蟲，并不能排除入境木片中未攜帶松材線蟲。此外，由于分離到的線蟲液中松材線蟲的含量過低也可能導致PCR無法檢測，因此，應進一步開展PCR檢測方法的靈敏度研究。

［1］夏彥飛，李紅梅，王暄，等.病木樣本松材線蟲DNA檢測方法研究［J］.江蘇農業科學，2009(1):35－38.

［2］劉裕蘭，王中康，曹月青，等.松材線蟲PCR標準化陽性對照構建及檢測體系的建立［J］.應用與環境生物學報，2008，14(1):122－125.

［3］FUKUSHIGE H，FUTAI K.Characteristics of egg shell and the morphology offemaletail － tipsofBursaphelenchusxylophilus，B.Lignicolus and some trains of related species from France［J］.Jpn J Nemat，1985，15:49－54.

［4］劉光明，蘇文金，蔡慧農，等.基于分子信標探針的熒光定量PCR方法檢測轉基因食品［J］.應用與環境生物學報，2006，12(2):273－277.

［5］王娜，馬雅軍，王喆之，等.PCR相關技術方法在植物病害檢測中的應用 (綜述)［J］.上海農業學報，2004，20(4):112－115.