齊墩果酸對S180荷瘤小鼠細胞色素C和Caspase－3表達的影響

吳勃巖，王雪，董靜，劉文波，孫陽，郭艷瑩，王曉軍

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

細胞凋亡與腫瘤發生發展的關系密切，是近年來腫瘤研究領域的熱點，誘導腫瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的重要途徑。齊墩果酸(Olesnolic Acid，簡稱OA)是一種天然產物化學成分，廣泛存在于女貞子、白花蛇舌草、夏枯草、烏梅、三七、山茱萸、山楂、丁香、連翹等植物中。齊墩果酸具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫雙向調解、抑瘤、促凋亡等多種藥理作用［1－3］。本文研究齊墩果酸對肉瘤S180荷瘤小鼠線粒體凋亡途徑中相關蛋白細胞色素C和Caspase－3表達的影響，探討其抗腫瘤作用機制，為齊墩果酸用于臨床治療腫瘤奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，6～8周齡，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物、瘤株和試劑

齊墩果酸(Sigma公司);小鼠S180腹水瘤株(購于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院);細胞色素C和Caspase－3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 實驗方法

2.1 復制腫瘤動物模型

在無菌的條件下取傳代后7天生長良好的S180腹水瘤株，用無菌生理鹽水按1∶3稀釋，以0.2ml/只接種于小鼠右側腋下，待其長為實體瘤，陽性率為100%。

2.2 檢測腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3蛋白含量

將接種S180腫瘤細胞的小鼠隨機分為模型組，齊墩果酸高、中、低劑量組，環磷酰胺組。于接種瘤細胞6h后首次給藥，齊墩果酸高、中、低劑量組分別按4.992mg/kg、2.496mg/kg、1.248mg/kg 灌胃給藥，環磷酰胺(CY)組40mg/kg腹腔注射，腫瘤模型組以生理鹽水0.2ml/只灌胃，連續給藥8天，每日1次。斷髓處死小鼠，剝離瘤組織，10%甲醛固定，選用免疫組化法常規制片，檢測細胞色素C和Caspase－3蛋白含量(按試劑盒說明書步驟操作)。利用Motic Images Advanced 3.2分析軟件對各組腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3蛋白陽性細胞平均光密度值進行分析。統計數據結果以(均數±標準差)表示，以SPSS 17.0軟件處理，采用t檢驗。

3 結果

齊墩果酸能上調S180荷瘤小鼠腫瘤細胞內細胞色素C的釋放和Caspase－3蛋白的表達。經免疫組化法染色后觀察腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3的表達，陽性反應均定位于胞膜和胞漿內(棕黃色或棕褐色顆粒)。通過10×40高倍鏡下觀察標本，每張切片隨機選取五個視野，選取視野內的所有陽性顆粒，并利用分析軟件對各腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3陽性細胞平均光密度值進行分析。與模型組比較，給藥組的細胞色素C平均光密度值有所升高，齊墩果酸高劑量組和齊墩果酸中劑量組與模型組比較差異極顯著(P＜0.01);低劑量組與模型組比較存在顯著差異(P＜0.05)。與模型組比較，給藥組的Caspase－3平均光密度值均有所升高，齊墩果酸高、中、低三個劑量組與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，結果見表1。

表1 齊墩果酸對S180荷瘤小鼠腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3表達的影響(s)

表1 齊墩果酸對S180荷瘤小鼠腫瘤組織中細胞色素C和Caspase－3表達的影響(s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

10 0.1495 ±0.02048 0.1188 ±0.01246 CY組 40 10 0.2181 ±0.01831＊＊ 0.2384±0.01133＊＊OA高劑量組 4.992 10 0.2076±0.00930＊＊ 0.2250±0.01788＊＊OA中劑量組 2.496 10 0.1727±0.01385＊＊ 0.1862±0.02380＊＊OA 低劑量組 1.248 10 0.1659 ±0.01267* 0.1572 ±0.02180平均光密度值細胞色素C Cspase－3模型組 —組別 給藥量(mg/kg)n＊＊

4 討論

誘導腫瘤細胞凋亡是近年來腫瘤研究的熱點之一。細胞凋亡是機體清除突變和受損細胞的主要機制，凋亡過程的啟動與實施受多種分子的調控，這些關鍵分子的異常表達和功能改變與腫瘤的發生發展密切相關，通過控制凋亡途徑中的關鍵蛋白或酶類的表達或功能，誘導腫瘤細胞凋亡，已成為腫瘤治療中頗具吸引力的分子靶點。抑癌基因p53能激活線粒體介導的細胞凋亡途徑，p53 通過下調 Bcl－2 蛋白［4－5］，上調Bax蛋白而誘導細胞凋亡;p53也可以誘導細胞色素C及Caspase蛋白的釋放，促進細胞凋亡。

哺乳動物細胞程序性死亡的主要路徑是由線粒體介導的內源性細胞凋亡通路，線粒體不僅是為真核細胞代謝提供能量的工廠，還是細胞凋亡的主要調控中心。細胞色素C在細胞凋亡中起開關作用，是線粒體電子傳遞鏈中的一員。線粒體在受到凋亡信號刺激時，會釋放出促凋亡因子如細胞色素C到細胞漿中，與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf－1)結合并激活，繼而引發Caspase家族的級聯激活，切割細胞結構蛋白，發生細胞凋亡。

Caspase家族在凋亡程序中起到執行者的作用，一旦被激活，細胞凋亡將不可避免的進行下去，上游的Caspase就能順次激活下游的Caspase，形成Caspase級聯反應，將凋亡信號一級級傳遞至凋亡底物，完成細胞凋亡過程。Caspase家族在介導細胞凋亡途徑的過程中具有非常重要的作用，是細胞凋亡的中心環節，而Caspase－3是細胞凋亡最為關鍵的執行分子，在各種因素誘導的凋亡程序中起最后的樞紐作用，是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶。Caspase還能夠降解細胞凋亡抑制因子，如Bcl－2等。Caspase水解Bcl－2家族，在除去抗凋亡因子的同時還可以激活促凋亡因子，加速凋亡的進程，因此Caspase家族在細胞凋亡中處于中心地位。免疫組化結果提示，齊墩果酸能促進S180荷瘤小鼠腫瘤細胞內細胞色素C的釋放和Caspase－3蛋白的表達，從而實現誘導腫瘤細胞凋亡達到抗腫瘤的作用，其機制可能與線粒體通路有關。

［1］王奇，蘆柏震.齊墩果酸的研究進展［J］.中國藥房，2008，19(9):711－712.

［2］吳勃巖.女貞子有效成分齊墩果酸對S180荷瘤小鼠抑瘤作用及存活時間的影響［J］.中醫藥信息，2010，27(1):37 －38.

［3］董靜，李明珠，吳勃巖.原位末端標記法檢測齊墩果酸誘導細胞凋亡的實驗研究［J］.中醫藥信息，2013，30(3):134 －135.

［4］吳勃巖.齊墩果酸對肉瘤S－180荷瘤小鼠細胞凋亡相關基因表達的影響［J］.中醫藥信息，2011，28(6):34 －35.

［5］吳勃巖，董靜，高明，等.齊墩果酸對S180荷瘤小鼠P53蛋白表達及 TNF－α 的影響［J］.國際遺傳學雜志，2010，33(4):63－64.