貝母花的定性鑒別及含量測(cè)定研究

崔明超，程斌，陳宏降，陳云

(浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江 寧波 315100)

貝母花為百合科植物浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥帶莖梢的花［1］，別名浙貝花、象貝花，主產(chǎn)于浙江鄞州、磐安等地。貝母花一般是在3～4月植株最后兩朵花開放時(shí)采摘干燥，具有止咳化痰之功效。

本文采用TLC對(duì)貝母花進(jìn)行了定性鑒別，ELSDHPLC法進(jìn)行定量檢測(cè)貝母素甲和貝母素乙的含量，建立了簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性好的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效高效液相色譜儀，Agilent 380蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。貝母花藥材采自寧波市鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校楊雄志教授進(jìn)行品種鑒定。貝母素甲對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110750－201110)，貝母素乙對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110751－201111)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;乙醇、鹽酸、乙酸乙酯、石油醚(60℃ ～90℃)、三氯甲烷、甲醇等試劑(寧波化學(xué)試劑有限公司，分析純或色譜純;硅膠G板(青島海洋化工分廠)。

2 定性鑒別

2.1 對(duì)照品溶液

取貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1mL含貝母素甲、貝母素乙各2mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液

取貝母花粉末5g，加乙醇50mL，水浴回流提取2h，提取液置水浴上蒸干，浸膏用2%鹽酸15mL溶解，濾過，酸水液用石油醚萃取2次，每次15mL，乙酸乙酯萃取2次，每次15mL，酸水液用氨水調(diào)節(jié)至pH=10，三氯甲烷萃取1次，15mL，置水浴蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使其溶解，作為供試品溶液。

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－濃氨試液(17:2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果在與對(duì)照品色譜相同的位置上，各供試品色譜均顯相同顏色的斑點(diǎn)(見圖1)。

圖1 貝母花的薄層色譜鑒別

3 含量測(cè)定

貝母素甲和貝母素乙均為貝母花中主要有效成分［2］，且含量較高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此以貝母素甲和貝母素乙為含量測(cè)定指標(biāo)。

3.1 色譜條件

Lichrospher－C18色譜柱(5μm，4.6mm ×150mm);流動(dòng)相:乙腈 －水 －三乙胺(68∶32∶0.03)，流速:1.0mg/mL;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL［3］。Agilent 380蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件:漂移管溫度:90℃，氮?dú)饬魉?2.2L/min。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取貝母素甲和貝母素乙的對(duì)照品適量，加甲醇制成每 1mL含貝母素甲 1.850mg、貝母素乙1.880mg的混和溶液，作為母液。從中精密量取10mL，甲醇稀釋至100mL，制成每1mL含貝母素甲0.185mg、貝母素乙0.188mg的混合溶液，備用。

3.3 供試品溶液制備

取貝母花粉末(過三號(hào)篩)約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液5mL，浸潤(rùn)1h，精密加入三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液50mL，稱定重量，混勻，加熱回流2h，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至1mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得［3］。

3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

精密吸取含貝母素甲0.185mg/mL和貝母素乙0.188mg/mL 對(duì)照液 10μL，各供試品溶液 20μL，注入高效液相色譜儀［4］。理論塔板數(shù)分別以貝母素甲峰和貝母素乙峰計(jì)，均不低于2000，貝母素甲峰與其他相鄰峰基線分離，分離度 R＞1.5，保留時(shí)間約為9min，貝母素乙峰與其他相鄰峰基線分離，分離度R＞1.5，保留時(shí)間約為11min(見圖2)。

圖2 貝母素甲和貝母素乙混合對(duì)照品HPLC色譜圖

3.5 線性關(guān)系考察

精密量取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、9.0mL 含貝母素甲0.185mg/mL和貝母素乙0.188mg/mL混合對(duì)照品溶液，定容至10mL量瓶中，搖勻，制成系列溶液［5］。

精密吸取上述6個(gè)不同濃度的對(duì)照液各10μL，注入高效液相色譜儀，按上述檢測(cè)條件測(cè)定峰面積。分別以貝母素甲和貝母素乙的濃度C(mg/mL)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以貝母素甲和貝母素乙平均峰面積的對(duì)數(shù)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:lgA1=1.573lgC1+2.295(r=0.9998)，線性范圍 0.0185 ～0.185mg/mL，lgA2=1.545lgC2+2.269(r=0.9997)，線性范圍0.0188 ～0.188mg/mL。

3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以樣品中貝母素甲和貝母素乙的總含量計(jì)算RSD，RSD=0.691%(n=6)，顯示該方法具有良好的精密度［6］。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試液分別于0、2、4、6、8、10h 按上述條件進(jìn)行測(cè)定［7］，結(jié)果貝母素甲峰面積值的RSD為0.76%，貝母素乙峰面積值的RSD為0.25%，說明貝母素甲和貝母素乙在10h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 專屬性試驗(yàn)

在上述條件下，精密吸取貝母花陰性對(duì)照液20μL，注入高效液相色譜儀［8］。圖譜顯示陰性無干擾，表明在貝母花中，貝母素甲和貝母素乙的專屬性較強(qiáng)。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品(120605)約2g，精密稱定6份，按上述方法測(cè)定，測(cè)得樣品中貝母素甲和貝母素乙的總含量，結(jié)果RSD=2.25%，顯示重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取批號(hào)為120605的貝母花2g，精密稱定6份，分別精密加入濃度為0.373mg/mL的貝母素甲和貝母素乙的混合對(duì)照液3.7mL，按上述方法制得供試液并測(cè)得樣品中貝母素甲和貝母素乙的總含量［9］(見表1)。

表1 貝母素甲和貝母素乙總量加樣回收率試驗(yàn)

3.11 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照液10μL，供試液20μL，注入高效液相色譜儀(見圖3)。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算其含量，測(cè)得貝母花中貝母素甲和貝母素乙的總含量平均值為0.136%(見表2)。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

圖3 貝母花樣品液HPLC色譜圖

上述實(shí)驗(yàn)中，曾參考浙貝母的定性鑒別方法，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，影響薄層展開效果。方法改進(jìn)后貝母花的鑒別專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。含量測(cè)定中對(duì)貝母花中含量較多的貝母素甲和貝母素乙進(jìn)行了含量測(cè)定，從精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收試驗(yàn)結(jié)果可以看出，HPLC－ELSD方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適用于貝母花中生物堿含量的測(cè)定。

以上實(shí)驗(yàn)表明，貝母花中含有貝母素甲、貝母素乙以及其他生物堿類成分，此類成分已證實(shí)為浙貝母中鎮(zhèn)咳祛痰的主要成分［10］。筆者所測(cè)批次中，貝母花的貝母素甲及貝母素乙的總量高達(dá)0.136%，超出《中國(guó)藥典》(2010版)中浙貝母中對(duì)貝母素甲和貝母素乙含量的最低要求(0.080%)，可能為貝母花止咳化痰的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。從理論上講，貝母花有著與浙貝母相近的祛痰效果，但尚需進(jìn)一步藥理及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)。但姜艷［11］等也發(fā)現(xiàn)，浙貝母不同的產(chǎn)地以及不同的規(guī)格貝母素甲和貝母素乙的含量相差很大，貝母花是否也存在著產(chǎn)地的差異，還有待于進(jìn)一步研究。

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