中藥川貝對哮喘模型小鼠VEGF和HIF－1α表達的影響

李厚忠，任公平，張羽飛

(1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011;2.牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011;3.牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

哮喘患者肺組織經常伴有新生血管的生成，來自哮喘患者活組織檢查發現不論血管的數量還是粗細都有所增加，這些改變可引起氣道阻塞或(和)氣道高反應性，從而加重哮喘［1］。目前，治療哮喘的一般方法是應用糖皮質激素、白三烯受體拮抗藥等［2］，由于不良反應嚴重，患者很難接受，尋找安全有效的中藥就顯得更加重要。中藥川貝治療哮喘安全可靠，可作為首選。

既往研究表明，血管內皮細胞生長因子(VEGF)在血管生成過程中起核心作用［3］。最新研究發現，VEGF調節血管生成是通過缺氧誘導因子－1α(HIF－1α)發揮作用的［4］，HIF－1α 可以調節基因表達響應氧氣濃度的變化。本研究建立哮喘小鼠模型，通過檢測氣道炎癥、血管百分比以及血管生成與VEGF和HIF－1α的關系，探討中藥川貝治療哮喘的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號:P00102008。

1.2 試藥

中藥川貝粉的制備:選取整齊、粉性足者。由于川貝忌水洗，因此采用潔凈的紗布擦拭藥材表面去除藥材表面的灰塵。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15min后直接轉至粉碎車間，Fz－400型粉碎機組加工成100目細粉，收得的細粉裝入潔凈的容器中。全部加工完后的細粉用潔凈的塑料袋分裝成1kg/袋備用。

1.3 模型建立

健康清潔級BALB/C小鼠腹腔內注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1ml作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發小鼠哮喘發作，隔日1次，每次20min，共激發28天。以小鼠出現口唇發紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩等表現表示成功激發。將成功制備的哮喘模型小鼠(20只)隨機分為2組(每組10只)。分別為模型組和中藥川貝組，另設PBS組(10只，以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入給藥)。分組后每天灌胃給藥，模型組和PBS組給予等量生理鹽水，中藥川貝組給予川貝粉9.0g/kg，每日1次，連續28天。最后1次給藥2h后，三組小鼠用1%巴比妥鈉麻醉，取出肺組織保存，用于組織學檢測。

1.4 免疫組化法檢測VEGF和HIF－1α表達、計算血管百分比

肺組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3%H2O2中15min滅活內源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。切片與血管性血友病因子(vWF)初級抗體孵育。VEGF和HIF－1α分別4℃過夜，隨后與二氨基聯苯胺孵育。用均勻結合在內皮細胞表面的vWF抗體標記血管，所有的后續步驟均在ZSGB－BIO Autostainer進行。隨機選定1個HPF(200×)視野，像場的總面積除以vWF陽性面積既得血管百分比，免疫組化染色支氣管上皮細胞用于計算VEGF與HIF－1α表達。

1.5 Western blotting檢測VEGF與HIF－1α表達

在蛋白酶抑制劑的存在下肺組織勻漿，以獲得肺蛋白提取物，用于Western blotting分析，使用bca－100蛋白定量分析試劑盒確定濃度。每組蛋白質等量(30μG)固定SDS聚丙烯酰胺凝膠，然后轉移到硝酸纖維素膜，膜在三異丙基乙磺酰緩沖鹽水吐溫20(25 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，和 0.1%Tween 20)中用5%的脫脂奶粉封閉1h，與原發性抗VEGF抗體或抗－HIF－1抗體4℃過夜孵育，然后與二抗雜交(Dako，1∶2000)，增強化學發光顯示特異性結合，以βactin為內參，X射線掃描，計算機輔助雙向光密度計分析光密度，計算VEGF和HIF－1α表達的相對比例。

1.6 組織學分析

肺組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數字顯微鏡掃描。根據組織學評分系統對支氣管周圍炎癥進行評分:1)支氣管周圍無炎細胞;2)可見少量炎細胞;3)大量炎細胞，但是沒有完全浸潤支氣管;4)1層炎細胞完全浸潤支氣管;5)2層炎細胞完全浸潤支氣管;6)3層或者更多炎細胞完全浸潤支氣管。用所有肺組織的支氣管除以有炎癥的支氣管計算平均支氣管炎癥指數。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 中藥川貝降低血管生成

OVA致敏后，血管生成(見圖1)。模型組血管百分比明顯升高，與PBS組比較，差異具有統計學意義(P＜0.01)。給予中藥川貝干預后，血管百分比明顯降低，與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.01)(見表1)。

2.2 中藥川貝降低VEGF表達

模型組支氣管上皮細胞，肺泡上皮細胞和內皮細胞VEGF表達明顯升高，中藥川貝干預后，VEGF表達接近PBS組(見圖2，表1)。Western blotting結果顯示，模型組VEGF表達明顯升高，與PBS組比較，差異具有統計學意義(P＜0.01);中藥川貝干預后，VEGF表達降低，與PBS組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(見圖3，表1)。

圖1 小鼠肺組織vWF陽性血管面積(200×)

圖2 小鼠肺組織VEGF表達(200×)

圖3 Western blotting結果

圖4 小鼠肺組織HIF－1α表達(400×)

表1 中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響(n=10，s)

表1 中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響(n=10，s)

注:與 PBS組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，※※P ＜0.01，※P ＜0.05。

模型組 中藥川貝組 PBS組血管百分比 2.82 ±0.78※※ 0.77 ±0.13＊＊1.60 ±0.15 0.42 ±0.10 VEGF 表達 93.29 ±1.55※※26.25 ±1.08＊＊ 23.08 ±2.79 VEGF 表達相對比 2.08 ±0.30※※ 1.12 ±0.22＊＊ 0.96 ±0.30 HIF －1α 表達 89.60 ±0.79※※71.70 ±1.40＊＊ 11.70 ±0.30 HIF －1α 表達相對比 0.97 ±0.30※ 0.88 ±0.47＊＊ 0.32 ±0.12平均炎癥指數 4.79 ±0.21※※ 2.91 ±0.17＊＊

2.3 中藥川貝降低HIF－1α表達

為進一步闡明中藥川貝抗血管生成機制，本實驗還檢測了肺組織HIF－1α表達水平。PBS組僅可見少量HIF－1α陽性細胞，而模型組肺泡上皮細胞核HIF－1α高表達(見圖3，圖4)。Western blotting檢測HIF－1α相對比，模型組HIF－1α表達上調，與PBS組比較，差異具有統計學意義(P＜0.01);中藥川貝組HIF－1α表達下調，與模型組比較，差異具有統計學意義(P ＜0.05)(見表1)。

2.4 血管百分比與VEGF和HIF－1α表達相關性

Western blotting結果顯示(見圖3)，血管百分比與 VEGF(r=0.693，P ＜0.01)和 HIF －1α(r=0.785，P＜0.01)表達呈正相關，因此VEGF和HIF－1α表達呈正相關(r=0.641，P ＜0.05)。

2.5 中藥川貝改善過敏性氣道炎癥

組織學分析顯示，模型組呈典型哮喘病理特征(見圖5A)。許多炎細胞浸潤支氣管周圍，支氣管上皮增厚，與PBS組比較炎癥指標明顯增強，差異具有統計學意義(P＜0.01)(見表1)。給予中藥川貝干預后，氣道炎癥明顯改善，炎細胞減少，支氣管上皮增厚范圍縮小(見圖5B)，與模型組比較，差異具有統計學意義(P ＜0.01)(見表1)。

圖5 小鼠肺組織組織病理學切片(200×)

3 討論

為闡明中藥川貝抗血管形成機制，本實驗檢測了平均炎細胞指數和血管百分比。哮喘模型小鼠肺組織可見大量炎細胞浸潤支氣管周圍，同時支氣管上皮細胞損傷，炎癥是哮喘加重的一個重要因素［5］。炎癥效應細胞(肥大細胞，嗜堿性粒細胞，巨噬細胞等)是血管形成的主要誘因，這與哮喘患者血管生成增多相一致［6－9］，哮喘模型小鼠血管百分比明顯增加。本研究發現，中藥川貝不僅可以改善氣道炎癥，而且可以減少血管生成，結果證實中藥川貝具有抗血管生成作用。

本研究證實了VEGF和HIF－1α表達的關系。VEGF的激活受HIF－1α調控，哮喘發作時HIF－1α表達增加，從而使VEGF表達上調，最終引起血管生成增加，這與文獻結果相一致。

在哮喘模型小鼠上還發現支氣管上皮細胞，肺泡內皮細胞和血管內皮細胞VEGF表達增加，此結果明確了VEGF表達和血管百分比之間的關系。眾所周知，在血管生成過程中，VEGF起核心作用［10］。中藥川貝降低VEGF表達，抑制內皮細胞增殖和血管生成，最終降低血管百分比，VEGF表達降低可能是中藥川貝抗血管生成的機制之一。

綜上所述，中藥川貝可以減輕氣道炎癥，降低VEGF和HIF－1α表達，從而抑制哮喘模型小鼠肺組織血管生成，本研究證實中藥川貝具有較好的治療哮喘的作用。

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