超聲波法提取丹酚酸B的工藝研究

王鳳儒，李鳳霞，金娟

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參為唇形科植物丹參(Radix Salviae Miltiorrhizae Bag)的干燥根和根莖。別名赤參，又叫紫丹參，紅根。是雙子葉植物唇形科的干燥根及根莖。我國主要分布于山西省、安徽省、河南省、甘肅省、四川省等地。《神農本草經》等歷代本草均有收載。丹參歸心、肝經，藥性微寒，味苦、無毒，具有祛瘀止痛、活血調經、養心除煩的功效［1］。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統疾病，具有擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、改善微循環、降低心肌耗氧量、防治心肌缺血和心肌梗塞等作用。臨床研究表明，丹參化學提取物具有促進組織的修復與再生能力，包括清除壞死心肌細胞，促使肉芽形成，改善肝臟微循環，抗菌消炎等功效［2］。丹參的主要化學成分包括以丹參酚酸B為代表的水溶性酚酸類化合物和以丹參酮A為代表的醇溶性菲醌類化合物。其中脂溶性成分包括丹參酮、異丹參酮、丹參酸甲酯等。傳統的丹參酮A的提取方法為水提醇沉，熱堿提取法等，這也是目前制備丹參注射提取方法常用方法［3－6］。本文主要探討超聲波提取法對丹酚酸的最佳工藝，以擴大超聲波提取丹參酚酸B的應用。

1 材料與儀器

RE522OA型旋轉蒸發器(上海振捷實驗設備有限公司);KQ2200E型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1200);丹酚酸B標準品(中國食品藥品檢定研究院，2013007);甲醇、乙腈、甲酸等試劑均為國產色譜純。

2 方法

2.1 超聲波法提取工藝

稱取適量預處理的丹參粉末，單因素試驗和正交試驗超聲波提取，浸提液4000r/min離心10min，上清液即為丹酚酸B的粗提液。在粗提液中加入無水乙醇至乙醇濃度80%，靜置沉淀過夜。抽濾，沉淀經自然干燥后稱重，以定提取物得率與丹酚酸B含量為指標，確定最佳提取工藝。

2.2 丹酚酸B含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend－C18(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:甲醇:乙腈:甲酸:水(30:10:1:59);流速:1.5mL/min;波長:λ =286nm;進樣體積:20μL;保留時間:20min;理論塔板數按丹參酚酸B峰計算不低于2000。

2.2.2 制備標準曲線

精密稱定丹酚酸B對照品25mg，水解并定容至50mL。稀釋丹酚酸 B濃度為 0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL標準液，分別按照2.2.1條件進樣。以丹酚酸B濃度X為橫坐標，峰面積 Y為縱坐標，Y=416.73X－16.312，R2=0.9999，得標準回歸曲線。

2.2.3 待測溶液的制備

稱取提取浸膏5g，置50mL量筒中，使充分溶解，濾過，精密量取續濾液1mL，至10mL容量瓶中定容。

2.2.4 樣品中丹酚酸B測定

吸取待測溶液20μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結果與結論

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比

保持提取溫度40℃，提取時間30min，超聲波頻率40kHz，料液比分別為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35提取，結果見圖1。隨著提取溶劑(水)的增加，丹酚酸B提取率逐漸升高，料液比為1∶25以后，隨著料液比的增大得率增加趨勢趨于緩和。因此，選擇料液比1∶15，1∶20，1∶25 三個水平進行正交試驗。

3.1.2 提取溫度

保持料液比1∶20、提取時間30min、超聲波頻率40kHz，提取溫度分別為 30、40、50、60、70℃提取，結果見圖2。50℃ ～60℃之間多糖的提取率明顯增加，60℃時達到最高值，超過60℃時，提取率下降。因此，選擇提取溫度40℃，50℃，60℃三個水平進行正交試驗。

3.1.3 提取時間

保持料液比1∶20、提取溫度50℃、超聲波頻率40kHz，分別在 20，25、30、35、40min 條件下提取，結果見圖3。提取時間為30min時，得率最高，此后下降。推測隨受熱時間延長，部分丹酚酸B降解。綜合考慮丹酚酸B的得率和節約能源，提取時間較為適宜的3個水平為25、30、35min，以此三個水平進行正交試驗。

圖2 提取溫度對丹酚酸B得率的影響

圖3 提取時間對丹酚酸B得率的影響

3.1.4 超聲波頻率

保持料液比 1∶20，提取溫度 50℃，提取時間30min，超聲波頻率分別為 20，30，40，50，60kHz 時提取，結果見圖4。超聲波頻率在40kHz之前丹酚酸B得率明顯上升，此后略有下降。因此，選擇超聲波頻率為30，40，50kHz三個水平進行正交試驗。

圖4 超聲波頻率對丹酚酸B得率的影響

3.2 正交試驗

采用L9(34)正交設計，試驗結果見表1。

影響丹酚酸B得率的主次為溫度＞時間＞超聲頻率＞料液比。確定最佳提取工藝為提取溫度40℃、提取時間25min、提取超聲頻率30kHz、料液比1∶25為理論最佳工藝。

按照理論最佳提取工藝，丹酚酸B提取得率為13.31%。

4 討論

從丹參中提取丹酚酸B的過程主要有破碎、提取、沉淀、干燥等，是影響回收率和產品質量的主要環節。參考相關丹酚酸B提取的文獻，主要提取方法有中性熱水提取，水煎法，回流提取，超臨界CO2，浸漬法。傳統的丹參提取法提取丹參酸B得率低，對有效成分的破壞大，影響產品最終收率，并且產生大量雜質，影響到用藥安全。超聲波作為一種新的提取手段，提取效率高、經濟方便、破碎效果好本試驗確定提取丹酚酸B的最佳工藝組合為料液比1∶25、提取溫度40℃、提取時間25min、超聲波頻率30kHz，丹酚酸B得率達13.31%，這種工藝提取出的浸膏量大并且含量較高。

［1］唐召力，覃碧云，滕秋葉，等.丹參多酚酸鹽與丹參注射液對不穩定型心絞痛氧化修飾低密度脂蛋白、血友病因子和超敏C反應蛋白的作用比較［J］.臨床薈萃，2012，27(17):1495 －1497.

［2］杜中良，程振田.正交試驗法優選丹參中丹酚酸B的提取工藝［J］.中國藥房，2010，31(3):35 －44.

［3］高秀梅，邢永發，姬艷蘇.丹參酚酸B、丹參酮治療心血管疾病的藥理學研究進展［J］.上海中醫藥雜志，2012，44(7):82 －85.

［4］李學林，姚保杰，李春曉.丹參及其制劑對血小板功能影響的研究進展［J］.中國藥房，2013，24(7):670 －672.

［5］楊立波，陳延軍，郝東偉.注射用丹參多酚酸鹽聯合通心絡膠囊治療不穩定型心絞痛的臨床觀察［J］.中國醫藥科學，2012，6(11):59－62.

［6］王鳳儒，李鳳霞，金娟.丹參多酚酸鹽對冠心病患者免疫相關指標的影響［J］.中醫藥學報，2014，42(3):181 －183.