藍萼香茶菜二萜類物質的提取工藝及其急毒實驗的研究

張冰月，郎軼詠，王強

(1.北京大學香港科技大學醫學中心，廣東 深圳 518000;2.解放軍第二0二醫院，遼寧 沈陽 110000)

藍萼甲素(glaucocalyxin A)是從唇科香茶菜屬植物香茶菜中提取分離出的一個二萜化合物。藍萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物［1］，生于山谷、林下、草叢中，分布于東北及河北、山西、山東等地。又名回菜花、香茶菜、山蘇子、野蘇子等，其全草或葉入藥能健胃消食，清熱解毒，活血［2］，主治脘腹脹痛，食滯納呆，脅痛，黃疸，感冒發熱，乳癰，蛇蟲咬傷等［3］。藍萼香茶菜在我國資源豐富，近幾年又發現新的二萜類、三萜類、黃酮及其他化學成分，其中有些成分現有研究已明確具有藥理活性［4］。二萜類化合物具有明顯的保護心肌細胞以及抗血小板聚集作用［5－7］。血小板具有黏附、聚集和釋放等功能，這與血小板具有止血和凝血作用有關。正常的血小板活化是體內生理性止血的必需步驟，而病理性血小板活化與血栓性疾病相關。研究顯示，患有栓塞性心腦系統疾病(如冠心病、心絞痛、心肌梗死)的諸多患者，其體循環中的血小板對ADP、AA誘導的聚集性顯著增高［8－9］。因此，抑制血小板聚集的異常發生，對于血栓栓塞性心腦血管疾病的預防和治療具有積極的意義。本實驗以冬凌草甲素為對照品，采用紫外分光光度計測定不同提取工藝提取的藍萼香茶菜總二萜的含量;采用RP－HPLC法測定不同提取工藝藍萼香茶菜中藍萼甲素含量;通過花生四烯酸(AA)和ADP誘導的血小板聚集試驗測定藍萼甲素對家兔體外血小板聚集的作用，考察藍萼香茶菜中總二萜類物質抗凝血作用，為開發新型心腦血管藥物奠定基礎。

1 材料和儀器

1.1 藥品

藍萼香茶菜(2010年9月采自撫順新賓地區，由沈陽市解放軍202醫院制劑室制備);95%乙醇(批號20120114，沈陽鑫金馳商貿責任有限公司);蒸餾水(解放軍202醫院制劑室提供);甲醇(批號20111208，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司);丙酮(批號T20110110，分析純，國藥集團化學試劑有限公司);活性炭粉狀(批號20100622，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司);藍萼甲素(純度≥98%，HPLC，沈陽市解放軍202醫院制劑室提供，動物體外實驗用DMSO助溶);蒸餾水(解放軍202醫院制劑室提供);花生四烯酸試劑及ADP試劑(美國Sigma公司)。

1.2 動物

昆明種小鼠，體質量20g左右，雄性40只。由沈陽市雙義動物研究所提供，動物合格證號:SCXK(遼):2010－001。試驗期間由解放軍二0二醫院動物實驗中心提供無菌固體飼料，自由飲水。

1.3 儀器

EYELA旋轉蒸發儀(日本東京理化株式會社);EYELA循環水式多用真空泵(日本東京理化株式會社);EYELA水浴鍋(日本東京理化株式會社);Lab Tech H35冷凝器(美國Lab Tech公司);FA2004型電子天平，(上海天平儀器廠);電子萬用爐(北京市光明醫療儀器廠);電熱恒溫培養干燥兩用箱(廈門醫療電子儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 藍萼香茶菜總二萜提取

2.1.1 加熱回流法1

取藍萼香茶菜地上部分，精密稱取該植物干葉，搓碎后置于圓底燒瓶中，加8～10倍的95%乙醇沒過藥材，80℃加熱回流提取三次，提取時間分別為8h、6h、6h，過濾、合并濾液，減壓濃縮制得稠浸膏1。用甲醇溶解稠浸膏1并進行過濾，濾液加1/100活性炭脫色，并對甲醇進行回收，使之濃縮，形成稠浸膏2，再加丙酮溶解并進行過濾，取濾液濃縮成稠浸膏3，如圖1a所示。將所得稠浸膏全部放入干燥箱內干燥粉碎，備用。

2.1.2 加熱回流法2

初始過程如2.2.1法操作，得稠浸膏2后，將過濾過程中的濾渣加乙酸乙酯溶解，經過濾紙過濾，回收乙酸乙酯，加熱濃縮成稠浸膏3;這一過程中會留下不溶的濾渣，對這些濾渣用甲醇進行溶解，回收甲醇并濃縮，形成稠浸膏4;如圖1b所示，將所得稠浸膏全部放入干燥箱內干燥粉碎，備用。

2.1.3 冷浸法

取藍萼香茶菜全草，精密稱取該植物干葉置密封的容器中，加入8～10倍量體積分數95%乙醇冷浸。共浸泡7天，其間每隔半天攪拌1次，使有效成分溶解到溶液中，過濾，取濾液;藥渣壓榨，再將濾液與榨出液合并，靜置5日后濾出藥液;對藥渣進行再次壓榨，并合并浸出液與榨出液，靜置3日后，對合并的液體再進行過濾，對所得濾液進行減壓濃縮，制得稠浸膏。用甲醇溶解稠浸膏并過濾，對濾液按1/100活性炭進行脫色，回收甲醇使之濃縮成稠浸膏，再加丙酮使之溶解，濾過，取濾液濃縮成稠浸膏;過濾過程中的濾渣全部留下，加乙酸乙酯溶解，過濾，然后回收乙酸乙酯的同時使液體濃縮成稠浸膏;不溶的濾過的濾渣添加甲醇溶解為液體，繼續回收甲醇再使之濃縮成稠浸膏;將所得稠浸膏全部放入干燥箱內干燥粉碎，備用。如圖1c。

2.2 藍萼香茶菜總二萜含量的測定

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取冬凌草甲素標準品3mg，置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制及測定方法

分別精密稱取不同方法所制得的藍萼香茶菜提取物置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶液并定容至刻度，再分別精密量取1mL于50mL容量瓶中，加95%乙醇溶液定容至刻度，即得不同方法制得的藍萼香茶菜提取物供試液。以95%乙醇為空白溶媒，于238nm波長下測定各組吸光度值，代入標準曲線方程計算提取物中總二萜含量。

2.2.3 標準曲線的繪制

化學研究表明，最具有活性成分的二萜和三萜成分均可以以在藍萼香茶菜莖葉部分中提取到，而二萜類最重要的成分是藍萼甲素，它的化學式相似于冬凌草甲素，故在使用紫外－分光光度法測定其有效物質含量時，可以冬凌草甲素為標準品，其最大吸收波長在238nm 處。分別精密量取對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5mL 于 10mL 容量瓶中，以 95%乙醇稀釋至刻度，得系列濃度的溶液。以95%乙醇為空白溶媒，在238nm波長下測定各系列濃度對照品的吸光度A，根據吸光度A繪制標準曲線。

圖1 藍萼香茶菜總二萜提取流程圖

2.3 急性毒性實驗

取18～22g健康小鼠40只，隨機分為4組，雌雄各半，實驗前12h禁食不禁水。根據藍萼香茶菜灌胃給藥(藥液濃度最高為0.01g/ml)。根據預試結果，確定一次灌胃給藥最高劑量為0.002g/kg，最低劑量為0.00025g/kg，劑量比 1∶0.5。灌胃容積 0.2ml/10g，給藥后，記錄動物死亡及反應情況，連續觀察7天。

2.4 統計學處理

采用SPSS 17.0對實驗數據進行用SPSS曲線估計模型擬合，P＜0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 標準曲線繪制

以橫坐標為濃度(C)，縱坐標為吸光度(A)，如圖2。標準曲線測定結果(見圖2)表明該標準品在3～45mg/L濃度范圍內，濃度與吸光度呈良好的線性關系，線性回歸方程為 A=0.0275C－0.0106(R2=0.9994)。

圖2 吸光度A與濃度C的標準曲線

3.2 提取工藝對藍萼香茶菜干燥品中總二萜含量的影響

結合稀釋濃度、干燥品總二萜重量、所用的生藥重量，計算得出藍萼香茶菜干燥品中被95%乙醇所提取的二萜類物質百分含量以及每克原藥材重所含總二萜含量，結果如表1。

表1 不同提取工藝制得藍萼香茶菜干燥品中有效成份含量的分析

3.3 急性毒性實驗結果

用簡化機率法計算LD50及LD50的95%平均可信區間。結果表明，LD50=1.090mg/kg，LD50的95%平均可信限 L95=0.001490 ～0.0007978(見表2)。

表2 藍萼香茶菜對小鼠灌胃給藥LD50實驗結果(n=10)

4 討論

最佳的提取工藝對藥物的分子量、溶解度、化學穩定性、提取量等都有一定的影響，本實驗最開始對三種最佳提取工藝進行了研究。考慮到各溶劑的提取效率、毒性、成本、提取量等因素，在藍萼香茶菜急性毒實驗的提取工藝中，使用95%乙醇為溶劑。

三種方法提取藍萼香茶菜莖葉部分生藥中總二萜含量最高的是第二種，第一種其次，但是綜合考慮各方法的提取效率、毒性、成本、灌胃性狀等因素，建議在藍萼香茶菜動物實驗中，使用第一種方法提出的藍萼香茶菜總二萜。

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