補陽還五湯對腦缺血后大鼠NF－κB/p50表達的影響

郭樂，周賽男，藺曉源，易健，郭純，劉柏炎，蔡光先

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學省部共建中醫內科學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007)

腦血管疾病患者輕則遺留殘疾，重則失去生命，絕大多數需終生治療，讓醫者在治療上感到非常棘手。我國每年治療費用中用于腦卒中多達數百億元，缺血性腦血管病(ICVD)占用其中很大一部分。近些年，腦缺血后大腦炎癥反應的作用機制方面的研究受到重視，其中核轉錄因子(NF－κB)在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷中的作用引起了學術界的關注［1］。補陽還五湯對腦缺血炎癥反應抗炎效果明顯，抗炎機制受到關注，因此深入研究補陽還五湯是如何有效的減輕炎癥損傷的作用機制有重要的意義。本實驗將補陽還五湯作為研究對象，探討了補陽還五湯多時間點長時間段對ICVD神經功能的保護作用，并觀察其對腦缺血后NF－κB的影響?，F將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量(280±20)g，共180只，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，動物許可證號:SCXK(湘)2009－0004，動物合格證號:004535。

1.1.2 藥物 補陽還五湯處方來源于王清任所著的《醫林改錯》，處方組成:黃芪 120g，當歸 6g，赤芍4.5g，芍藥 3g，地龍 3g，紅花 3g，桃仁 3g。藥材購自湖南省藥材公司，經湖南中醫藥研究院鑒定均符合《中國藥典》有關規定。補陽還五湯的制備:先用清水浸泡30min，第一煎加藥材5倍體積的蒸餾水，煎汁30min，第二煎5倍體積蒸餾水，煎汁30min，兩煎混合，濃縮至含生藥2g/mL，冷藏備用。米諾環素(惠氏制藥有限公司，國藥準字號 H10960010，批號2009077)。

1.1.3 主要試劑 水合氯醛(中國上海白鶴化工廠);鼠抗鼠NF－κB/p50單克隆抗體(abcam公司);PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽，美國sigma公司);DMSO(二甲基亞砜，北京索萊寶有限公司);PDTC用DMSO溶解，再用生理鹽水稀釋;AEC顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司);SABC試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.1.4 主要儀器 自動雙重純水蒸餾器(上海玻璃儀器一廠);ZD－600電熱恒溫水浴箱(杭州藍天化驗儀器廠);BX5l光學顯微鏡和IPP5.1圖像分析系統(日本Olympus公司);FA型電子天平(上海臺之衡電子衡器有限公司);E60冰凍切片機(英國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將動物隨機分為空白組，假手術組，模型組、PDTC+模型組、補陽還五湯+模型組，米諾環素+模型組，共6組。每組30只，給予不同處理。

1.2.2 模型建立 參照Longa報道［2］的方法，采用大鼠大腦中動脈線栓法(MCAO)復制局灶性腦缺血模型。術后動物自由飲水、進食。動物于清醒后2h參照文獻［3］進行神經功能評分，分值在1～3分者入組，死亡等原因剔除的動物隨機替補。假手術組僅作皮膚切開及血管剝離后隨即縫合，不做栓線處理。

1.2.3 給藥 動物術后開始給藥，補陽還五湯，米諾環素均按成人與動物體表面積折算，補陽還五湯大鼠以體質量 250g計算為 5g/(kg·d)，米諾環素為2.35g/(kg·d)，加蒸餾水按相同的灌胃體積配制各濃度藥液，每日灌胃1次。模型組和假手術組動物均給予等體積蒸餾水。PDTC按100mg/(kg·d)確定給藥量，腹腔注射。

1.2.4 指標檢測

1.2.4.1 神經功能評分 參照文獻［3］5級評分方法進行評分。無神經損傷癥狀，0分;不能完全伸展對側前爪，1分;向癱瘓側轉圈，2分;向對側傾倒，3分;不能自發行走，意識喪失，4分。各組動物在處死前2h進行評分。

1.2.4.2 免疫組化檢測 手術后7、14、21天處死大鼠，10%水合氯醛麻醉后，灌注取腦，然后放入蔗糖溶液中進行梯度脫水，運用單標酶學免疫組織化學法檢測NF－κB/P50表達。將染好的切片在顯微鏡下觀察并拍照。每張切片隨機選取6個高倍鏡視野(×400)，分別計數各視野的陽性細胞數，并取其均值作為每組樣本的陽性細胞數。

1.2.5 統計學處理 統計分析應用SPSS 16.0統計軟件，所有數據均采用均數±標準差(s)表示。多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD法檢驗，方差不齊用Dunnet’s T3法檢驗，P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補陽還五湯對MCAO模型大鼠神經功能評分的影響 假手術組無明顯神經功能缺損癥狀。經過造模后模型組、各用藥組共死亡30只，同時隨機替補。用藥7天、14天、21天后，模型組的神經功能評分較假手術組顯著增加(P＜0.01)。補陽還五湯組、米諾環素組、PDTC組神經功能評分與模型組比較明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，但其組間比較，差異不具有統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 補陽還五湯對MCAO大鼠神經功能癥狀評分的影響(s，n=10)

表1 補陽還五湯對MCAO大鼠神經功能癥狀評分的影響(s，n=10)

注:與模型組比較，#P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 7天 14天 21天0.00 ±0.00假手術組 0.00 ±0.00▲模型組 1.33 ±0.21 1.13 ±0.13 1.25 ±0.16補陽還五湯組 0.50 ±0.22# 0.63 ±0.18# 0.50 ±0.19▲米諾環素組 0.67±0.33# 0.50±0.19▲ 0.63±0.18▲PDTC 組 0.67 ±0.21# 0.63 ±0.18# 0.71 ±0.18正常組#

2.2 補陽還五湯對MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50表達的影響

免疫組化結果顯示，NF－κB/p50蛋白在細胞核、胞漿內均有表達，表達部位染色呈現棕紅色，細胞核為圓形或橢圓形。正常組與假手術組可見少量NF－κB/p50陽性細胞表達，陽性細胞于各腦區散在分布。腦缺血后即可見NF－κB/p50蛋白陽性細胞大量增加，主要集中在梗死周圍區、海馬回區或皮質，密集分布。補陽還五湯組、米諾環素組、PDTC組7天、14天、21天各時間點陽性細胞數依次減少，與模型組比較也均有統計學差異(P＜0.05或P＜0.01);7天、14天各用藥組間比較，差異不具有統計學意義(P＞0.05);而21天組，補陽還五湯組與PDTC組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 補陽還五湯對MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50陽性細胞數的影響(s，n=6)

表2 補陽還五湯對MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50陽性細胞數的影響(s，n=6)

注:與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與補陽還五湯組比較，☆P ＜0.05。

組別 7天 14天 21天正常組 36.17 ±5.83▲ 33.83 ±5.43▲ 40.50 ±4.11▲假手術組 34.33±7.34▲ 42.67±6.98▲ 37.50±4.98▲模型組 271.83 ±27.62 234.00 ±17.99 128.67 ±10.46補陽還五湯組 145.00 ±13.14# 71.33 ±10.53▲ 35.83 ±7.10▲米諾環素組 128.83 ±6.95# 70.67 ±9.64▲ 43.83 ±7.06▲PDTC 組 132.50 ±9.76# 69.17 ±6.85▲ 57.00 ±2.96▲☆

3 討論

根據ICVD的臨床癥狀，可將其歸屬于中醫學“中風”的范疇。補陽還五湯主要治療氣虛血瘀型中風，關于其能促進腦梗死患者的神經功能康復臨床報道亦不少見［4］。實驗研究方面證實，其能通過多種途徑對抗 ICVD 的不良損傷［5］，本課題組前期研究［6－8］也證實，補陽還五湯能促進缺血腦組織的神經干細胞的增殖，大腦海馬區增殖明顯，還可通過影響腦缺血后移植神經干細胞的存活及分化，從而加快腦缺血后神經功能的恢復。近些年，腦缺血后大腦炎癥反應的研究受到重視，補陽還五湯在腦缺血后炎癥反應方面的作用機制研究逐漸受到關注，且其抗炎效果顯著，有待進一步揭示。

圖1 補陽還五湯對14天MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50免疫組織化學染色結果(×400)

NF－κB［9］是 Rel蛋白家族中的一組重要的核內轉錄因子，研究發現其在細胞炎癥反應、細胞凋亡等病理過程中發揮著重要的作用［1］。它主要以Rel家族蛋白亞基組成的同源或異源性二聚體的形式存在，目前最多的就是由多肽鏈p50和p65形成的異源性二聚體。Blondeau等研究表明，局灶性腦缺血模型動物經過缺血預處理后，可誘導缺血耐受，表現出NF－κB表達受到抑制，大腦缺血梗死灶體積縮小，從而減輕了神經功能缺損［10］。NF－κB通路與腦缺血后炎癥反應的關系密切，報道越來越多，研究也越來越具體，針對腦缺血損傷后炎癥反應的NF－κB信號通路的研究也成為目前開發治療ICVD新藥的研究靶點。本實驗將NF－κB信號通路中的NF－κB/p50因子作為研究對象深入揭示補陽還五湯治療腦缺血的作用機制。

研究結果顯示，補陽還五湯組、米諾環素組、PDTC組7天、14天、21天各時間點的神經功能評分均較模型組明顯減小，而其組間差異不具有統計學意義。上述用藥組各時間點NF－κB/p50陽性細胞數減少，與模型組比較均有統計學差異，且補陽還五湯21天組與PDTC組比較差異亦有統計學意義。以上結果說明，補陽還五湯可能通過調節NF－κBp/50蛋白表達，從而達到減輕神經細胞缺血性損傷而起到腦保護作用。由此推測，補陽還五湯和米諾環素，PDTC一樣能通過調節NF－κB信號通路來抑制腦缺血損傷的炎癥反應，改善神經功能。

［1］Antony P，Petro JB，Carlesso G，et al.B cell receptor directs the activation of NFAT and NF－kappaB via distinct molecular mechanisms［J］.Expcell Res，2003，291(1):11 －24.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91.

［3］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472 －476.

［4］李書霖，李巖，劉慧.李延教授運用補陽還五湯治驗舉隅［J］.中醫藥學報，2012，40(1):106 －107.

［5］徐晶，辛隨成，張青川.補陽還五湯治療缺血性腦血管病的研究進展［J］.山西中醫學院學報，2009，10(4):73 －76.

［6］蔡光先，劉柏炎.補陽還五湯對體外低糖低氧損傷海馬干神經增殖的影響［J］.湖南中醫學院學報，2005，25(2):1 －3.

［7］劉柏炎，蔡光先.補陽還五湯對低糖低氧損傷神經干細胞移分化的影響［J］.中國藥物與臨床，2005，5(3):171 －173.

［8］劉柏炎，蔡光先，陳雪梅，等.補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血后神經再生的影響［J］.中華神經醫學雜志，2007，6(8):762 －765.

［9］薛劍，周忠光，姜波，等.補陽還五湯對 AD大鼠海馬區 NF－κBp65mRNA基因表達的影響［J］.中醫藥學報，2014，42(3):36－38.

［10］Blondeau N，Widmann C，Lazdunski M，et al.Activation of the nuclear factor － kappaB is a key event in brain tolerance［J］.J Neurosci，2001，21(13):4668 －4677.