六神丸對人肺癌A549細胞血管內皮生長因子表達的影響

齊元富，鄭祎，黃利敏

(1.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011;2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

肺癌嚴重威脅人類生命和健康，是全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。我國肺癌病死率在城市已居腫瘤死亡首位，對肺癌的防治研究成為當今醫學領域中重要的科研課題。六神丸方的組成包括麝香、牛黃、冰片、珍珠、制蟾酥、明雄黃，有清熱解毒，消腫止痛的功效。筆者在前期的臨床研究中發現六神丸能明顯改善中晚期肺癌患者的生存質量，穩定瘤灶，控制轉移，減輕化療的毒副作用［1］。本實驗通過體外實驗探討六神丸治療肺癌的作用機制。

1 材料

實驗所需細胞株、藥物、試劑及儀器參見本課題組前期研究結果［2－5］。用適量生理鹽水將研磨碎的六神丸溶解至實驗所需濃度(8.4mg/kg)，在4℃保存備用。

將35只SD大鼠(雄性，體質量200g左右)隨機分為對照組和觀察組，其中對照組10只，觀察組25只。觀察組每日灌胃2次，每次給予六神丸溶液4ml，對照組每日給予等量生理鹽水灌胃，連續3天。末次灌胃(灌藥前禁食12h)后1h用戊巴比妥鈉將其麻醉，從后腹主動脈及心室采血，無菌分離血清，滅活除菌后分裝入小瓶，保存于－20℃。

2 方法

2.1 細胞培養及懸液制備

常規培養A549細胞，待細胞長滿瓶底約80% 時進行傳代，實驗時取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液配制成1×105個/ml的細胞懸液備用。

2.2 MTT法檢測細胞增殖

實驗分為對照組(10%正常鼠血清組)和觀察組，觀察組再分為六神丸含藥血清組、順鉑(DDP)組(DDP:1μg/ml)及DDP+六神丸聯合組，其中六神丸含藥血清組和聯合組再分為5%、10%、15%、20%、25%五個梯度濃度組，共12組，每組再設8個復孔。將細胞懸液接種于96孔平底培養板中，每孔加入200μl，調零孔組為右下方剩余孔。將各組細胞常規培養，待細胞生長旺盛貼壁后，去掉原培養液，加入各濃度含藥血清繼續培養24、48、72h。于培養結束前4h加入濃度為5mg/ml的噻唑藍(MTT)20μl/孔，繼續培養4h，棄液，再加入二甲基亞砜(DMDSO)200μl/孔，震蕩5min，用酶標儀于波長490nm處檢測OD值，重復實驗3次取平均OD值。生長抑制率IR(%)=(1－實驗組平均OD值/空白對照平均OD值)×100%。

2.3 免疫組化法檢測VEGF表達

將A549細胞懸液接種于經過高溫消毒的蓋玻片，并放入6孔板內，待細胞爬滿玻片后棄培養液，加入不同濃度的血清及實驗藥物，再繼續培養24h。后續實驗步驟按試劑盒操作，封片后，將各組免疫組化片置于光學顯微鏡下觀察，陽性細胞即胞質、胞核和胞膜為棕黃色顆粒者，選擇陽性細胞較集中的區域，采集5個光鏡視野輸入到高清晰度彩色病理圖文分析系統中，進行計算機完全定量分析。

2.4 RT－PCR法檢測VEGF mRNA表達

實驗分為對照組、5%、10%、15%含藥鼠血清組、DDP組及DDP+10%含藥鼠血清組，收集各組細胞，按總RNA抽提試劑盒操作步驟提取各組細胞總RNA，經分光光度儀測定 RNA濃度和純度，A260/A280均在1.8～2.0之間，可以繼續實驗。取3μg總RNA于42℃逆轉錄1h后，以內參照基因(β－actin)作為內對照，進行半定量聚合酶鏈反應(PCR)擴增。VEGF:上游 5－TCGGGCCTCCGAAA －CCATGA －3'，下游5'－CCTGGTGAGAGATCTGGTTC －3'，基因片斷長度為:516bp、648bp、720bp、771bp。β － actin:上游 5'－CGCTGCGCT－GGTCGTCGACA －3'，下游 5'－GTCACGCACGATTTC2CGCT－3'，基因片斷長度為500bp。引物均由上海生物工程有限公司合成。取RT產物5μl，進行 PCR 反應:95℃預變性5min，94℃變性30s，56℃ ～60℃復性 1min，72℃延伸 1min，共 30 個循環。采用Alpha凝膠成像系統攝取圖像，結果以目的條帶與對應的β－actin密度比值表示。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 六神丸對A549細胞增殖的抑制作用

實驗結果顯示，六神丸含藥血清能一定程度上抑制A549細胞增殖(5%藥血清組與對照組相比P＞0.05，其余含藥血清組、DDP及聯合組與對照組相比P＜0.05)，抑制作用隨血藥濃度增高而增強;DDP與六神丸含藥血清合用，對抑制細胞增殖有明顯的協同作用(P ＜0.05)。

3.2 六神丸對A549細胞VEGF蛋白表達的影響

結果見表1，圖1。各含藥鼠血清組、DDP組及聯合組的VEGF表達明顯低于對照組，有顯著性差異(P＜0.05或0.01);VEGF表達量與六神丸濃度負相關;同時結果顯示聯合組的抑制作用更顯著，表明二者合用有協同作用。

表1 六神丸含藥血清對A549細胞VEGF表達的影響(s)

表1 六神丸含藥血清對A549細胞VEGF表達的影響(s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 DDP組相比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 視野(n)平均光密度 平均灰度5 0.3069 ±0.03434 164.7 ±15.36 5%含藥鼠血清組 5 0.2510±0.03196＊△△ 150.5±13.82△△10%含藥鼠血清組 5 0.2035±0.04562＊＊△△ 123.3 ±10.24＊＊△△15%含藥鼠血清組 5 0.1637±0.02199＊＊ 109.5±16.34＊＊DDP 組 5 0.1546±0.02130＊＊ 101.4 ±8.944＊＊DDP+10%含藥鼠血清組 5 0.1007±0.0259＊＊△△ 85.8±10.20對照組＊＊△△

圖1 六神丸對A549細胞VEGF蛋白表達的影響

3.3 六神丸對A549細胞VEGF mRNA表達的影響

結果見表2，圖2。實驗結果顯示，各含藥鼠血清組、DDP組及聯合組的VEGF mRNA表達明顯低于對照組，有顯著性差異(P＜0.01)，表明VEGF mRNA表達量與六神丸的濃度成反比;聯合組對VEGF mRNA表達的抑制作用更顯著，表明DDP對六神丸的抑制作用有協同效果。

表2 六神丸含藥血清對A549細胞VEGF mRNA的相對表達量(s)

表2 六神丸含藥血清對A549細胞VEGF mRNA的相對表達量(s)

注:與對照組相比，＊＊P ＜0.01;與 DDP組相比，△△P ＜0.01。

組別 n RATIO(%)77.53 ±14.70 5%含藥鼠血清組 6 65.96 ±10.63＊＊△△10%含藥鼠血清組 6 52.87 ±5.82＊＊△△15%含藥鼠血清組 6 41.22 ±3.18＊＊DDP 組 6 40.04 ±4.37＊＊DDP+10%含藥鼠血清組 6 26.10 ±4.13對照組6＊＊△△

圖2 六神丸對A549細胞VEGF mRNA表達的影響

4 討論

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種由腫瘤細胞分泌的具有促進血管生成作用的重要細胞因子，它功能強大且能產生多種生物學效應，屬于血小板衍生生長因子超家族，現已發現的VEGF相關基因家族包括6個分泌型的糖蛋白，分別為 VEGF－A，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D，VEGF－E和胎盤生長因子(placentagrowth factor，PDGF)－land －2［6－9］。研究表明，VEGF 可促進內皮細胞滲透、激活、存活、增殖、浸潤和遷移，與腫瘤血管生成密切相關［10－13］。血管的生成對于腫瘤的生長和轉移起著重要作用，因此，抑制VEGF途徑被確認為是一種重要的、有效的抗癌模式。

本實驗結果證實，六神丸含藥血清能一定程度抑制人肺癌A549細胞的體外生長，與藥物濃度呈正相關，且與順鉑有協同作用。本研究通過免疫組化法及RT－PCR法檢測六神丸作用于人肺癌A549細胞對VEFG表達的影響，結果證實六神丸可顯著下調人肺癌A549細胞VEGF的表達，這可能是六神丸抑制肺癌細胞生長的主要機制之一。

中醫學認為，六淫外侵、飲食不節、五志過極等皆可于體內形成熱毒，熱毒灼傷陰津，煉液為痰，久而成瘀，阻滯于肺而發為肺癌。可見肺癌形成的重要病機之一即是“毒聚”。所以采用以毒攻毒治法，借助有毒之品的峻猛之力攻邪以消除毒聚。本實驗選取作為攻毒法代表方藥的六神丸從細胞及分子水平探索六神丸抗肺癌作用及其可能的分子機制，為其今后用于肺癌的治療提供科學依據。

［1］齊元富，鄭祎，侯倩倩.六神丸以毒攻毒治療非小細胞肺癌臨床研究［J］.遼寧中醫雜志，2013，40(1):6 －7.

［2］黃利敏.六神丸抗肺癌血管生成及信號轉導途徑的實驗及臨床研究［D］.濟南:山東中醫藥大學，2012:3－6.

［3］齊元富，李慧杰，劉寨東.納米雄黃對肺癌A549細胞增殖影響及其機制的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20(1):27 －30.

［4］劉寨東.雄黃納米化后誘導人肺癌細胞株凋亡及抗血管生成的體外研究［D］.濟南:山東中醫藥大學，2011:3－5.

［5］于連洋.納米雄黃干預肺癌A549細胞對VEGF及HIF－1表達的影響［D］.濟南:山東中醫藥大學，2012:2－3.

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