慢性束縛應激對大鼠睡眠時相的影響及酸棗仁湯的干預作用

張斌，張喬，馬英男

(1.哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江 哈爾濱 150525;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;3.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150076)

人的一生大約有1/3的時間是在睡眠中度過的，所以睡眠的質(zhì)量對維持機體健康狀態(tài)至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和工作壓力的日益增大，在臨床上常見由應激所導致的各種疾病［1］，且已有文獻研究表明，慢性應激會對整個睡眠結(jié)構(gòu)造成影響［2］。慢性束縛應激是使嚙齒類動物產(chǎn)生應激的經(jīng)典方法，國外已有慢性束縛應激對大鼠睡眠時相影響的文獻報道［3］。然而目前國內(nèi)慢性束縛應激的研究主要集中在模型復制后實驗動物的行為學研究和生化指標含量的測定上［4］，未見采用多導生理描記技術(shù)研究其對睡眠時相影響的報道。酸棗仁湯出自《金匱要略》，主治“虛煩不眠”，是目前中醫(yī)臨床上常用的治療失眠的經(jīng)典基礎(chǔ)方。

基于以上，本研究采用大鼠皮層腦電、肌電描記技術(shù)來考察慢性束縛應激對大鼠睡眠時相的影響，并在本課題組前期研究的基礎(chǔ)之上，探討了酸棗仁湯對慢性束縛應激所致大鼠睡眠時相改變的干預作用，以期為酸棗仁湯在臨床上更廣泛應用奠定前期實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠，8月齡，清潔級，體質(zhì)量(250±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心(GLP實驗室)提供，許可證號:黑動字第P00700619號。

1.2 實驗儀器

十六道生理記錄儀(MP－150型，美國BIOPAC公司);恒溫恒濕自動光控電子屏蔽室 (8:00～20:00自動明暗控制，P－22型，常州第二無線電廠);腦立體定位儀(大鼠用，美國Stoelting公司);自凝牙科水泥(批號04－08－05，哈爾濱齒科器材廠);大鼠慢性應激束縛器(自制，有機玻璃材料，口徑4cm，管壁有直徑為0.5cm的通風口，確保大鼠呼吸通暢)。

1.3 主要試劑

戊巴比妥鈉(批號WS20060401，國藥集團化學試劑有限公司，臨用時以生理鹽水配制成0.5%溶液);注射用青霉素鈉(批號A05065612，哈藥集團制藥總廠)。

1.4 實驗藥物

酸棗仁、茯苓、川芎、知母、甘草均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學生藥學教研室孫慧峰副教授鑒定，符合《中國藥典》的規(guī)定。

2 實驗方法

2.1 酸棗仁湯的制備

結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，按照酸棗仁湯中五味藥的比例(酸棗仁∶茯苓∶川芎∶知母∶甘草 =18∶5∶10∶10∶5)，稱取5 味藥材共 456g，加 8 倍量的水，浸泡1h后，沸水煎煮30min，濾過，藥渣再加6倍量水，沸后煎煮20min，濾過，合并兩次濾液，濃縮至700ml，使每毫升濃縮液中含生藥量的濃度為 0.65g/ml，備用。

2.2 大鼠皮層腦電與肌電電極的埋置

首先將Wistar大鼠在實驗環(huán)境下適應1周后再進行腦電和肌電電極的埋置。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg，待大鼠麻醉后，在腦立體定位儀上將其固定，剪掉頭部毛，酒精消毒后，剪開頭頂皮膚，撥開筋膜，用酸蝕劑腐蝕并充分暴露顱骨，用干脫脂棉擦凈，直至顱骨表面干潔。在顱骨上用大鼠腦立體定位儀定位(坐標:AP －2，R2;AP+2，R2)，用牙科電鉆鉆孔，將2個直徑為1mm不銹鋼螺絲釘植入顱骨內(nèi)，并使之與硬腦膜接觸，但不穿透硬腦膜，作為腦電皮層電極;用兩根酒精消毒后的導線穿過頭后方的頸肌，作為肌電電極。將電極螺絲釘用焊錫制成微型插頭，連接微型插座，在顱骨中間(坐標:AP+5，R0)鉆孔，植入螺絲用以固定微型電極插座，然后以牙科水泥固定，縫合毛皮層［5－6］。大鼠電極埋置后將每只實驗動物置于有機玻璃籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，腹腔注射4萬U青霉素鈉，連續(xù)3天以避免手術(shù)造成感染，恢復7天后，按照下述方法進行造模。

2.3 慢性束縛應激大鼠模型的復制

將大鼠置于有機玻璃制成的束縛管中，管壁有直徑為0.5cm的通風口，確保通風良好，大鼠能夠自由呼吸，大鼠在束縛管中雖然活動收到限制，但不會造成肉眼可見的軀體上的傷害，大鼠每日束縛應激時間為6小時(9:00～15:00)，連續(xù)14天，應激時禁水禁食，應激結(jié)束后，將大鼠放回籠中自由進食和飲水［7－8］。

2.4 實驗步驟

將24只Wistar雄性大鼠隨機分為3組，即空白組、模型組和給藥組，每組8只。模型組和給藥組大鼠按照2.3項下的方法進行造模，空白組大鼠不做任何應激刺激，只是在另2組大鼠造模期間禁水禁食(9:00～15:00)。給藥組大鼠自造模第1天開始灌胃酸棗仁湯16ml/kg，連續(xù)14天，空白組和模型組大鼠每日灌胃相同體積的生理鹽水。

模型復制后，采用十六道生理記錄儀描記每只大鼠12h(8:00～20:00)的腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)。實驗環(huán)境控制為避光、通風、隔音、電磁屏蔽狀態(tài)，采用自動定時光控系統(tǒng)對實驗環(huán)境實行每天12h(8:00～20:00)的明暗光照周期處理，屏蔽室內(nèi)溫度(25±2)℃，相對濕度40% ～60%。

2.5 大鼠睡眠時相劃分和定量分析指標

根據(jù)不同睡眠時相波形的特點［9］，將大鼠睡眠－覺醒周期分為覺醒(Wake)、淺睡期(LS)、慢波睡眠(SWS)和快動眼睡眠(REMS)等4個時相［10］。通過對大鼠EEG和EMG的分析，統(tǒng)計出每一類睡眠時相的持續(xù)時間和所占睡眠總時間的比例。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進行方差分析，設(shè)定P＜0.05為差異具有顯著意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 慢性束縛應激對大鼠各睡眠時相持續(xù)時間的影響及酸棗仁湯的干預作用

由表1和圖1可以看出，與空白組相比，模型組大鼠在睡眠總時間、LS、SWS以及REM睡眠的持續(xù)時間均顯著縮短(P＜0.05)，由圖1可以直觀看出，SWS期睡眠持續(xù)時間縮短的幅度較大。與模型組相比，酸棗仁湯給藥組大鼠在睡眠總時間、LS和SWS期睡眠持續(xù)時間均顯著延長(P＜0.05)，REM期睡眠雖有延長的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 慢性束縛應激對大鼠睡眠時相持續(xù)時間的影響及酸棗仁湯的干預作用

表1 慢性束縛應激對大鼠睡眠時相持續(xù)時間的影響及酸棗仁湯的干預作用(s)

表1 慢性束縛應激對大鼠睡眠時相持續(xù)時間的影響及酸棗仁湯的干預作用(s)

注:與空白組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05。

組別 n 睡眠總時間(min)LS(min)SWS(min)REM(min)空白組 8 356.7 ±86.1 180.9 ±54.5 142.8 ±50.3 35.2 ±12.2模型組 8 176.4 ±66.8*103.0 ±42.5*41.9 ±10.6*19.4 ±5.7*給藥組 8 260.3 ±77.6#145.0 ±70.1#93.1 ±44.8#22.5 ±7.3

表2 慢性束縛應激對大鼠睡眠各時相所占睡眠總時間比例的影響及酸棗仁湯的干預作用(s)

表2 慢性束縛應激對大鼠睡眠各時相所占睡眠總時間比例的影響及酸棗仁湯的干預作用(s)

注:與空白組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05。

組別 n LS(%)SWS(%)REM(%)空白組8 50.7 ±4.6 40.8 ±10.3 9.8 ±3.5模型組 8 62.3 ±6.5* 25.2 ±8.7* 11.5 ±3.2給藥組 8 55.7 ±5.1 35.8 ±9.1#8.6 ±3.9

圖2 慢性束縛應激對大鼠睡眠各時相所占睡眠總時間比例的影響及酸棗仁湯的干預作用

3.2 慢性束縛應激對大鼠各睡眠時相所占睡眠總時間比例的影響及酸棗仁湯的干預作用

由表2和圖2可見，與空白組相比，模型組大鼠LS期所占比例顯著增加(P＜0.05)，SWS期睡眠所占的比例則明顯減小(P＜0.05)，而REM期所占睡眠總時間的比例與空白組相比基本持平。與模型組相比，酸棗仁湯給藥組大鼠SWS期所占睡眠總時間的比例顯著提高(P＜0.05)，LS期和REM期睡眠所占比例雖有下降的趨勢，但是在統(tǒng)計學上無差異(P＞0.05)。

4 討論

應激是機體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時出現(xiàn)的非特異性的全身反應。當處于應激狀態(tài)時，機體需要調(diào)動各種代償機制去應對應激對機體的損傷，由此引起一系列生理、生化的改變，而長期慢性應激可引起機體代償機制失調(diào)，導致認知、情緒和內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化。已有研究證實，長期的慢性束縛應激可以影響大鼠體重的自然增長［11］，使大鼠自主活動減少［12］，表現(xiàn)出抑郁傾向，而且國外已有束縛應激對大鼠睡眠結(jié)構(gòu)影響的報道［13］。酸棗仁湯是中醫(yī)臨床上具有改善睡眠作用的經(jīng)典方劑，大量動物實驗研究也提示酸棗仁湯可以改善由慢性情緒應激所導致的睡眠障礙［14－15］。基于上述思路，本研究通過大鼠皮層腦電和肌電電極的埋置，監(jiān)測大鼠12h的EEG和EMG，進而探討酸棗仁湯對慢性束縛應激所致大鼠睡眠結(jié)構(gòu)改變的干預作用。

在復制大鼠慢性束縛應激的模型之前，先對大鼠進行皮層腦電和肌電電極的埋置，這一步驟十分關(guān)鍵，在用牙科電鉆穿透大鼠頭骨時的力量要拿捏適度，目的是剛好穿透大鼠頭骨，又不損傷腦膜，另外要確保大鼠暴露的頭骨用酸蝕劑擦拭得表面干潔，以便牙科水泥更好的固定，防止電極脫落。

LS期表示機體處于一種淺睡狀態(tài);而SWS期睡眠則是深睡眠狀態(tài)，這一期對于緩解軀體上的疲勞有著十分重要的作用;當機體處于REM期睡眠時，表明機體正處于“做夢期”，它對于緩解機體腦疲勞有十分重要的意義，這一期睡眠可以促進記憶的鞏固和兒童智力的發(fā)育。正常的睡眠結(jié)構(gòu)應該是各睡眠時相保持一定的持續(xù)時間并且占有相應的比例，如果睡眠的持續(xù)時間減少或者各個睡眠時相比例嚴重失調(diào)，就會影響睡眠的質(zhì)量。由本實驗結(jié)果可以看出，慢性束縛應激可以明顯縮短大鼠睡眠總時間、LS、SWS以及REM睡眠的持續(xù)時間，并改變了大鼠各睡眠時相所占睡眠總時間的正常比例，此時大鼠各睡眠時相間的平衡已被打亂，這和國外文獻報道的結(jié)果較為相似［13］;而酸棗仁湯可以明顯對抗慢性束縛應激對大鼠睡眠結(jié)構(gòu)造成的影響，表現(xiàn)為延長各睡眠時相的持續(xù)時間，部分恢復其所占睡眠總時間的比例。

本研究初步闡明了慢性束縛應激對大鼠睡眠結(jié)構(gòu)的影響，并從動物實驗角度明確了酸棗仁湯的藥效學基礎(chǔ)，這為本研究后續(xù)實驗，從神經(jīng)遞質(zhì)的層面來探討酸棗仁湯對抗慢性束縛應激所致睡眠障礙的機制奠定了前期研究基礎(chǔ)。

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