靈芝液體深層發酵技術研究進展

屈直++謝晴宜++馬海霞

摘 要 靈芝是我國著名的藥食兼用大型真菌。對近年來靈芝液體深層發酵技術在菌種選育、培養基優化以及發酵參數選擇等方面的研究進展進行總結闡述。

關鍵詞 靈芝 ；液體深層發酵技術 ；研究進展

分類號 Q939.97

Recent Advances in Liquid Submerged Fermentation Technology of

Ganoderma lucidum

QU Zhi XIE Qingyi MA Haixia

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Hainan 571101， China）

Abstract Ganoderma lucidum is famous for the medicinal fungi and new food resources. The recent advances in research on the stain improvement， medium optimization and the fermentation parameters selection were briefly introduced， as well as the prospect for the development of liquid submerged fermentation technology of Ganoderma lucidum.

Keywords Ganoderma lucidum ； liquid submerged fermentation ； research progress

靈芝（Ganoderma lucidum），俗稱赤芝、紅芝、木靈芝，古稱瑞草，是我國著名的藥食兼用大型真菌，其孢子、菌絲和子實體均可利用，藥用歷史悠久，古典醫書對靈芝的藥用功效均有記載，認為靈芝是祛病延年、滋補強壯、扶正固本、有利于機體保持或恢復穩態的珍貴藥品，可用于多種疾病的治療[1]。現代藥理研究表明，靈芝中已經分離到150 余種化合物，其中主要的生理活性物質為靈芝多糖和靈芝三萜，它們具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、消炎抗菌、保肝護肝、調節免疫、促進新陳代謝等功效，且幾乎無毒副作用，受到醫藥界的廣泛重視。傳統上，靈芝是通過野外采集或人工栽培獲得。目前，靈芝野生資源稀缺，而人工栽培投入成本高，生長周期長（2～3個月以上），勞動強度大，易受季節、環境、區域、原料等因素制約，品質難以控制[2-3]；此外，傳統上靈芝以子實體或孢子入藥，子實體味苦，木質化、纖維化程度高，孢子細胞壁厚，機體較難吸收利用，不宜直接用作食、藥原料[4]。1973年，林忠平等[5]以靈芝、紫芝為試驗材料，進行了一系列液體深層發酵技術的相關研究，此后，國內外學者相繼展開了對液體深層發酵技術的應用研究與探討，其培養技術日趨成熟和完善。與傳統方法相比，該技術具有周期短、成本低、產出多、利于工業化、培養物營養豐富且質量穩定，以及提取分離容易等優點，而且靈芝深層培養液苦味小，營養和藥用價值不低于子實體甚至有些指標高于子實體。液體深層發酵生產靈芝已顯示出明顯的優勢，具有廣闊的應用前景。

1 菌種選育研究

優良菌種的選育是提高靈芝液體深層發酵水平的基礎和關鍵。目前，常用的育種手段有自然選育、誘變育種和雜交育種。從野生靈芝經組織分離、純化所獲得的菌株，對自身固有的代謝調節系統較為依賴，趨于穩定生長和繁殖，長速慢，生產能力低，無法為液體深層發酵提供其所需的大量靈芝菌種[6]。從現有研究來看，采取孢子、原生質體等誘變育種仍是靈芝菌種選育主要途徑。朱芬等[7]在對供試靈芝菌株進行原生質體紫外誘變的基礎上，經過多重篩選試驗，獲得了菌絲干重和三萜含量穩定提高的誘變株UV-3。董玉瑋等[8]采用氯化鋰誘變赤靈芝原生質體，所得誘變株液體發酵目標產物產量有較大提高。董玉瑋等[9]采用紫外線與甲基磺酸乙酯、紫外線與氯化鋰復合誘變靈芝原生質體，所得誘變株胞外多糖產量較原發菌株分別提高49.75%和57.87%，遺傳穩定性較好。王淑珍等[10]對靈芝孢子進行紫外線與60CO-γ射線交替積累誘變處理，所得誘變株菌絲生長速度快，菌絲積累量、遺傳穩定性均較好。李穎穎等[11]、謝瑀婷等[12]通過低能N+離子注入方法誘變靈芝孢子，取得了較好的試驗結果。隨著遺傳學、生物化學、微生物學等學科的快速發展，轉化、轉導、原生質體融合、代謝調控和基因工程等已應用到靈芝育種中。高明俠等[13]采用原生質體電融合技術選育高產多糖菌株，所得融合株的生物量和多糖含量均高于親本菌株。李剛等[14]建立了通過PEG轉化緩沖液將外源基因轉入靈芝的方法，為通過基因工程手段定向、快速改良靈芝藥用品質以及利用靈芝發酵方法生產一些具有重大經濟價值的外源蛋白等應用奠定基礎。

此外，靈芝深層發酵優質高產菌株的篩選研究已開展較多，通過綜合比較分析菌絲生長速度、菌絲體生物量及目標產物含量等指標選育出適應性強、遺傳性狀穩定、目的產物得率高的優勢菌株。王磊等[15]比較了8 個靈芝菌株的菌絲生長速度、菌絲體生物量及多糖含量等指標，篩選出優勢菌株。宋頻然等[16]運用反饋抑制理論構建了耐靈芝胞外多糖（EPS）反饋抑制的篩選模型，并用其篩選37株靈芝菌株，最終檢出耐靈芝胞外多糖反饋抑制作用最強、產胞外多糖能力最強的菌株GL029。余素萍等[17]通過搖瓶培養試驗，從22個靈芝菌株中篩選出三萜高產菌株GL31。王雁萍等[18]應用添加亞硒酸鈉（Na2SeO3）的培養基篩選富硒能力較強、菌體生物量及菌體多糖產量均較高的菌株。

2 培養基優化

目前，已有較多學者對靈芝液體發酵培養基成份進行了優化研究，但是由于各研究的供試菌株及原材料有所不同，因此培養基優化的結果也不盡相同，無法進行相互比較。endprint

2.1 碳源

靈芝液體發酵所需的碳源來源廣泛，常見的有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉等。董元榮[19]開展了靈芝液體發酵所需碳源的篩選試驗，指出玉米粉為最佳碳源。余以剛等[20]研究了碳源對靈芝液態發酵的影響。結果表明，紅芝對單糖、雙糖和多糖均能較好地利用，其中以葡萄糖為碳源時得到的生物量和胞外粗多糖產量最多。劉冬等[21]對15 種常用碳源進行篩選研究，發現最適碳源單糖為葡萄糖，二糖為蔗糖，多糖為玉米粉、小麥面粉、麩皮粉或土豆粉，靈芝菌絲體的長速以在葡萄糖為碳源的液體培養基中最快，蔗糖次之，多糖最慢。此外，一般認為復合有機碳源更有利于靈芝菌及其次生代謝產物的生成。李平作等[22]研究顯示，除葡萄糖外，在培養基中添加組分較復雜且富含半纖維素、纖維素的復合碳源如玉米粉、酒糟等可獲得較好的發酵效果。復合碳源具有原料來源廣泛易得、成本低廉的優勢，適應產業化、規模化生產的需求。

2.2 氮源

氮源主要是合成靈芝真菌細胞合成核酸、蛋白質及次生代謝產物不可或缺的物質基礎。劉冬等[21]報道，用酵母膏、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨等有機氮源進行靈芝液體發酵時，菌絲體的產量明顯高于無機氮源，可見靈芝菌絲體對有機氮源的利用能力要優于無機氮源。Hsieh CY[23]研究表明，蛋白胨和酵母提取物對于靈芝菌絲的生長刺激作用顯著，但加入量過高會抑制細胞的生長和產量。常景玲[24]報道，將麩皮（5%）和蛋白胨（0.3%）搭配作為氮源，比單一的麩皮或蛋白胨作為氮源對菌絲體與多糖的產生更有利。

2.3 碳源、氮源濃度及碳氮比（C/N）

培養基的優化，除考量碳、氮源的組成外，碳、氮源濃度及合適的碳氮比也是需要著重考慮的。只有二者均在合適的濃度下，菌絲體才能兼顧生長和次生代謝產物的形成。李平作等[25]報道，較高的C/N有利于靈芝多糖的生成；在C/N確定時，太高的碳源濃度對菌絲體生長存在抑制作用，影響發酵周期；氮源濃度對發酵的周期影響不大，但對靈芝多糖及靈芝酸的產量是有影響的。劉冬等[21]研究認為，最佳碳氮比為23.6～31.1。Babitskaya[26]研究表明，當碳氮比值于18.0～25.0時，對多糖的生成最為有利。Hsieh CY[23]試驗證實，充分的碳源供給是保證菌絲體中多糖產量的關鍵。羅建成等[27]報道，靈芝菌絲體生物量和胞外多糖含量在一定的范圍內隨著葡萄糖含量增加而升高，但當葡萄糖含量大于5%時，靈芝菌絲體的生長將受到抑制。黃達明等[28]對碳源、氮源的篩選結果顯示，含有酮基的碳源、氮源要優于不含酮基的，且只有在一定的碳氮源濃度范圍內才能較好地合成靈芝酸。

2.4 無機鹽

靈芝在液體深層發酵過程中需要添加少量的無機鹽，如磷、鉀、鎂、硫和鈣等，菌絲生長的最基本元素為磷、鉀和鎂，磷參與糖代謝，鎂離子參與菌體生長，鉀對糖酵解有促進作用。劉冬等[21]報道，培養基中Mg2+、P5+缺乏對菌絲體生物量影響較大，而K+缺乏時菌絲體幾乎不生長。Hsieh CY[23]研究發現，磷酸鹽缺乏可導致胞內多糖產量顯著降低，而限量添加Mg2+則會獲得較低含量的大分子多糖。其它一些無機鹽，如鈣離子，一般使用碳酸鈣調節發酵液酸堿度；硒和鋅等元素，靈芝可將這些無機態的礦質元素生物富集，進而轉化成有機態的礦質元素，更易于人體吸收。魏賽金等[29]探討了在培養基中添加不同濃度的鋅離子對靈芝菌絲生長和液體發酵富集Zn2+的影響。胡志斌等[30]就不同水平亞硒酸鈉對靈芝液體發酵的影響進行了研究，數據顯示液體發酵培養基中硒濃度為250 μg/mL時獲得的菌絲體生物量最高。

2.5 生長因子

靈芝液體培養需要一定量維生素類物質，特別是維生素VB1（硫胺素），它在靈芝生長過程中不能自己合成，必需從外界補充，對靈芝菌絲體生長和生物活性物質生成有著重要作用。劉冬等[21]通過試驗發現，缺乏VB1、VB2對菌絲體生長有部分影響。胡煥榮[31]認為，在培養基中加入150 mg/L VB1，能促使靈芝菌絲體生長粗壯。陳芳莉等[32]探討了維生素與靈芝菌絲體生長及其胞外多糖生成間的關系，結果表明，VB2與VB6對菌絲體生長均有促進作用，且可使其生成較多的胞外多糖，VB2較VB6作用更為明顯。另據陳志玲等[33]報道，液體培養時加入適量的復合VB、VB1、鐵和鋅可使靈芝多糖及靈芝酸產量顯著地提高。

2.6 非必需營養因子

據有關報道，不同脂肪酸類物質、醇類及中藥提取物對靈芝液體深層發酵也有著不同的影響。Yang FC等[34]研究顯示，脂肪酸對靈芝菌絲體生長及次生代謝產物形成等有一定的影響。Yang HL等[35]研究認為，在液體發酵培養基中添加甲醇、乙醇和1-丙醇能使多糖產量分別提高1.0、2.4和1.8 倍。劉媛等[36]報道，在培養基中添加金銀花、淡豆豉、淡竹葉、連翹和甘草等對靈芝菌絲體生長及靈芝酸生成均有一定的促進作用；薄荷和蘆根能促進靈芝菌絲體生長，但不能促進靈芝酸生成。

3 發酵條件控制

靈芝液體深層發酵的目的是要得到高生物量及高產量的次生代謝產物；但在實際發酵過程中，二者難以同時達到高產，故此，要根據實際生產需要選擇有利于目標產物生成的發酵條件。

3.1 培養溫度

靈芝屬高溫型真菌，其深層發酵的溫度范圍較廣，在22～35℃內都可以生長。Babitskaya[26]報道，最適于供試菌株菌絲體生長和靈芝多糖積累的溫度范圍在25～30℃，低于25℃或高于30℃菌絲體生物量和靈芝多糖含量則顯著減少。Chang MY等[37]在研究中發現，靈芝液體發酵的最適溫度為34℃。綜上所述，最適溫度因不同情況而有所不同，存在一定的差異性，這可能與菌種本身及其它發酵因素（如培養基成分、pH值等）共同引起的。

3.2 pH值endprint

液體發酵過程中，培養基的pH值對菌絲體生長也存在較大的影響，過酸或過堿對靈芝菌絲體的生長都是不利的；pH值也是影響次生代謝產物產生的重要因素，其變化會導致各種酶活性的改變，從而影響次生代謝產物的形成。李平作等[37]研究顯示，適合于多糖形成的pH值與適合于菌絲生長的pH值并不一致。Fang QH等[39]針對液體發酵初始pH值對菌絲體生物量及其生物活性物質含量的影響進行了研究，結果表明初始pH值為6.5時，生物量和靈芝酸含量達到最高；而當初始pH值下降時，靈芝多糖含量隨之上升。Kim等[40]認為，靈芝發酵過程中分段控制pH值也是提高胞內多糖與胞外多糖的有效方法。凌慶枝等[41]試驗證明，pH值與菌絲生長、胞內外靈芝酸及胞外多糖生成緊密相關，菌絲生長及胞內靈芝酸形成最適pH值是5.5，胞外多糖形成最適pH值是4.6，胞外靈芝酸形成最適pH值是4.5。

3.3 培養時間

靈芝的液體深層發酵首先是搖瓶培養得到種子液，然后在發酵罐中發酵培養獲得大量的次生代謝產物。楊炎等[42]試驗發現，赤芝G2在液體深層發酵前32 h處于生長延滯期，生物量增加很小，而在發酵76 h生物量達到最高。余素萍等[43]研究顯示，菌絲中三萜類物質主要在培養后期大量生成，但并非培養時間越長，其含量就越高。培養至一定時間后，三萜類物質減少或只在組分間相對比例上有所變化。Yang FC等[44]報道，供試菌株在2 L發酵罐中進行液體發酵時，靈芝多糖含量從第2 d開始呈S型曲線上升，至第5 d達到最高濃度，且開始趨于穩定；此外，發酵罐中靈芝多糖的產出與通氣量還有著較大的關系。因此，實際生產中應根據目標產物來選擇適宜的培養時間。

3.4 種齡和接種量

生長旺盛、活力強的種子是菌絲體的生長和次生代謝產物產生的基礎。一般認為，處于對數生長中期的種子更有利于菌絲體的生長，搖瓶種子液的培養周期確定為3 d左右較好。

接種量的多少關系到菌絲體的生長、形態進而影響其次生代謝產物的生成。Fang QH等[45]認為，接種量干重在330 mg/L時，菌絲體干重可達到最高；當接種量干重在70～670 mg/L時，接種量減少，菌球直徑變大，靈芝酸含量增多；接種量增加，菌球直徑變小，多糖含量增多。由此可以看出，較低的接種量有利于靈芝酸的產生；而高的接種量有利于靈芝多糖的產生。楊炎等[42]試驗發現，接種量的確定應綜合培養周期和培養基的利用率，定為10%較為適宜。在實際生產過程中，應隨其它發酵條件的設置而所有差別，可根據所需的有效組分控制接種量。

3.5 振蕩頻率、轉速及溶氧

靈芝是好氧真菌，氧氣供給不足會抑制其生長代謝。種子液搖瓶培養時的振蕩頻率和發酵罐發酵時的轉速與通氣量，都和溶氧緊密相關。李平作等[46]在試驗中發現，在25 L發酵罐內選擇180 r/min的轉速和1∶0.75 v/v·m的通氣量效果較好，較高的轉速可致菌絲球較小，但有利于胞內多糖的形成[22]。Tang YJ等[47]報道低溶解氧（10%左右）時，菌絲體生長受阻，但胞外多糖和胞內多糖的產量卻高于溶解氧25%時的產量；除此還發現，初始體積溶氧系數（KLa）較高時可得到高生物量和高胞內多糖產量，當KLa再增加時，菌絲球直徑增大，發酵10 d后得到的靈芝酸產量較高。另據報道，在靈芝液體發酵過程中，其菌絲體生長與胞外多糖生成所需要的最適溶氧是基本一致的，均在 80%左右，超過這一水平，對胞外多糖的生成不利[48]。

4 展望

采用液體深層發酵技術培養靈芝，在一定程度上克服了采收野生靈芝和栽培靈芝的局限性。此外，該技術可在短時間內制備出的大量的優質液體菌種，縮短制備原種和栽培種時間，便于工廠大規模生產；通過發酵又可分泌得到大量的胞外活性物質，將其用于研究開發保健食品、保健藥品和治療藥物等。這些都極大地推動了液體深層發酵技術在靈芝中的應用。目前，學者們在優良菌株的選育、培養基的篩選、培養條件的優化、發酵工藝的改良等方面都進行了有益的探索，提高了靈芝液體深層發酵的技術水平，但在研究和生產中仍存在著一定的問題，如發酵培養基和工藝條件適用性不廣、菌種質量要求高、不同規模發酵結果差異較大、發酵過程易染菌、難以確定發酵終點、適于發酵工業的品種比較少、次生代謝產物產量還無法同子實體相比等。今后應從以下幾個方面加強研究：加強最適發酵培養基、培養條件的篩選和優化；采用理化誘變、原生質體融合和基因工程等方法選育優良菌種；找出發酵規模不同而致發酵結果差異的主要原因，設法縮小其差異；提高對發酵過程動態監控水平；改善液體工藝條件和發酵設備；根據不同的發酵目的和發酵工藝，綜合考慮經濟、產品質量等因素，確定發酵終點等。隨著靈芝液體深層發酵研究的系統和深入及各種生物反應器的研制成功，必將提高靈芝的發酵水平和資源利用效率，促進靈芝在醫藥食品等領域發揮更大的作用。

參考文獻

[1] 鄧叔群. 中國的真菌[M]. 北京：科學出版社，1963：1-808.

[2] 唐 力，邢繼強，韓玉澤，等. 不同產地靈芝中多糖含量的比較[J]. 黑龍江醫藥科學，1999，22（3）：17-18.

[3] 邢增濤，江漢湖，周昌艷，等. 不同靈芝中粗多糖含量的比較研究[J]. 食用菌，2001，23（6）：4-5.

[4] 陸正清. 靈芝液體深層發酵技術[J]. 江蘇食品與發酵，2007（3）：38-40.

[5] 林忠平，孫安慈，劉永安，等. 靈芝深層培養的研究[J]. 微生物學報，1973，13（2）：151-156.

[6] Zhou Y Q， Yang X T， Yang Q Y. Recent advances in liquid submerged fermentation for Ganoderma mushroom[J]. Food Reviews International， 2006， 2（2）：1-15.endprint