安祖花ISSR—PCR反應體系的優化和確立

楊京燕+葛亞英+田丹青

摘要：為建立適宜安祖花DNA 的 ISSR-PCR 擴增體系，采用單因子試驗對影響 ISSR-PCR 反應的各組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+ 濃度）進行了優化，確立了適合安祖花的條帶清晰、多態性高、重復性好的最佳 ISSR-PCR 反應體系，即在 20 μL PCR 反應體系中含有10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL；并利用2條引物對15個安祖花品種進行了穩定性鑒定，為安祖花的遺傳多樣性分析及育種工作提供技術支持。

關鍵詞：安祖花；ISSR；單因素試驗；體系優化

中圖分類號： S682.1+40.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0038-03

收稿日期：2014-03-12

基金項目：浙江省杭州市種子種苗專項（編號：20110332H14）；臺州科技職業學院科研課題。

作者簡介：楊京燕（1977—），女，浙江臺州人，碩士，講師，從事園林規劃設計、園林花卉栽培與育種研究。E-mail：robinyjy@163.com。

通信作者：葛亞英，碩士，助理研究員，主要從事花卉栽培與育種研究。E-mail：gyy954002@126.com。ISSR（inter-simlpe sequence repeat）是一種簡單重復序列擴增多態性分子標記，具有操作簡單、實驗成本低、DNA樣品用量少、多態性高、信息量大、重復性好等優點，已在品種鑒定、植物遺傳多樣性、物種的進化關系、系統學比較與物種分類等研究領域被廣泛應用[1]，目前已成功用于觀賞鳳梨、菊花、萬壽菊[2-4]等觀賞植物的遺傳多樣性、品種鑒定、指紋圖譜構建等領域。安祖花（Anthurium andraeanum Lind.）又名紅掌、花燭，是天南星科花燭屬多年生草本植物，具有奇特別致的葉形、色彩艷麗的佛焰苞和肉穗狀花序，已成為目前全球發展最快、需求量大的熱帶切花和盆栽花卉。安祖花品種繁多，深受消費者喜愛的花色、株型或者具有較強抗病性、抗逆性的安祖花類型具有很高的觀賞價值和經濟價值，也是育種的主要目標。欲獲得控制這些優良性狀的基因，就需要建立適合安祖花的 DNA體外擴增體系，繼而構建遺傳圖譜，對基因進行精確定位，加速育種工作進程。本研究通過提取安祖花葉片的基因組總DNA，并對ISSR反應體系中主要組分Taq DNA 聚合酶濃度、模板DNA 濃度、引物濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度等進行優化，確立的ISSR反應體系可為進一步利用ISSR標記技術開展安祖花種質資源遺傳多樣性研究、連鎖遺傳圖譜構建和控制優良性狀基因的 QTL 定位等方面奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為安祖花15個品種。

1.2方法

1.2.1基因組 DNA 提取用 CTAB 法提取基因組DNA[5]，DNA質量和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，統一稀釋為20 ng/μL，保存于 -20 ℃ 冰箱中備用。

1.2.2ISSR-PCR擴增PCR擴增選用的引物根據British Columbia 大學公布的ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成；10×Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、100 bp DNA marker 均購自杭州鼎國生物技術有限公司。擴增程序：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性45 s，52 ℃ 復性45 s，72 ℃ 延伸 90 s，共42個循環；72 ℃ 延伸 7 min后4 ℃ 保存。PCR 擴增在美國ABI Applied Biosystems 2720型PCR擴增儀上進行。

1.2.3ISSR-PCR反應體系的優化試驗試驗在基本擴增反應體系（20 μL反應體系中，10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物2.0 μL、20 ng/μL模板 1.0 μL）的基礎上，以UBC834為引物，對模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs和Mg2+ 5個影響ISSR-PCR擴增的主要因素開展單因子濃度試驗，各反應參數作4～6個水平的梯度優化（表1），PCR 擴增產物采用 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定各成分的最佳濃度，每個優化好了的參數直接用于下一個優化參數的反應體系中。

表1ISSR反應體系優化設計

影響因子濃度梯度模板DNA（ng/μL）0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0Taq DNA聚合酶（U）0.50、0.75、1.00、1.25、1.50引物（μmol/L）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0MgCl2（mmol/L）1.0、1.5、2.0、2.5dNTPs（mmol/L）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0

1.2.4ISSR反應體系引物篩選及檢測根據優化的ISSR反應體系，選用2個品種對48 條ISSR引物進行 PCR 擴增，擴增產物采用6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測，確定多態性較好且條帶清晰的引物，選用其中2條引物對15個品種進行多態性擴增檢測。

2結果與分析

2.1安祖花基因組DNA的提取

將用CTAB 法提取15份安祖花葉片得到的 DNA，通過瓊脂糖跑膠和分光光度計測定其質量和濃度，結果DNA條帶清晰，雜質含量較少，可以滿足ISSR的試驗要求。

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優化

2.2.1DNA模板量對PCR反應的影響試驗設置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時擴增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時擴增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復比較試驗，在2.0 ng/μL的模板用量時最穩定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時，擴增條帶比較弱，且條帶數少；當Taq酶用量為0.75～1.50 U時，均能擴增出明顯條帶。試驗中Taq 酶用量為1.0 U時擴增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時最適合該PCR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應的影響試驗中引物濃度的變化對產物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時雖然能擴增出產物，但是條帶數少且有些擴增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時均能擴增出清晰的條帶。經重復比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時反應穩定，條帶清晰且經濟，確定安祖花ISSR-PCR反應最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應的影響由可見，當Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴增條帶數增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時擴增產物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應的影響當dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時未擴增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時條帶缺失現象嚴重，且多數條帶模糊不清；當dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時擴增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時條帶最清晰穩定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應體系的穩定性鑒定及確立

根據各影響因子試驗結果，以反應體系中各組分最佳濃度進行引物篩選，篩選得到的引物隨機選取2條，對15個品種進行體系穩定性鑒定，結果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴增出條帶清晰、多態性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應體系是穩定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴增反應。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應體系為20 μL反應體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補充至20 μL。

3討論與結論

有關ISSR-PCR反應體系優化的報道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴增結果影響很大。本研究采用單因素試驗，對影響ISSR-PCR的各個反應因子進行單獨的梯度試驗，找出最佳反應條件。結果表明ISSR-PCR 反應受反應組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時各組分均有一個相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復性高等優點，但不同反應體系產生的結果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗條件下研究結果都有差異[10]。張紅心等對16個紅掌種質資源進行ISSR遺傳多樣性研究時采用的是25 μL ISSR反應體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗優化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個品種進行ISSR擴增分析，每個品種均能擴增出清晰條帶，并且多態性均達100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應體系穩定、可靠，同時也說明ISSR分子標記適合對安祖花進行遺傳多樣性分析。

本試驗建立的體系是采用單因素梯度試驗來進行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩定的條帶，這一優化的反應體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進一步利用ISSR分子標記技術對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構建及分子標記輔助育種等分子生物學研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標記與應用[M]. 北京：化學工業出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發棣，趙宏波，等. 應用ISSR對25個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關系的ISSR分析[J]. 中國農業科學，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗[J]. 江蘇農業科學，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應體系的優化[J]. 安徽農學通報，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應體系的建立[J]. 西北農業學報，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學會.中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術年會論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗檢測哺乳動物細胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：41-43.

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優化

2.2.1DNA模板量對PCR反應的影響試驗設置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時擴增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時擴增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復比較試驗，在2.0 ng/μL的模板用量時最穩定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時，擴增條帶比較弱，且條帶數少；當Taq酶用量為0.75～1.50 U時，均能擴增出明顯條帶。試驗中Taq 酶用量為1.0 U時擴增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時最適合該PCR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應的影響試驗中引物濃度的變化對產物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時雖然能擴增出產物，但是條帶數少且有些擴增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時均能擴增出清晰的條帶。經重復比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時反應穩定，條帶清晰且經濟，確定安祖花ISSR-PCR反應最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應的影響由可見，當Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴增條帶數增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時擴增產物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應的影響當dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時未擴增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時條帶缺失現象嚴重，且多數條帶模糊不清；當dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時擴增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時條帶最清晰穩定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應體系的穩定性鑒定及確立

根據各影響因子試驗結果，以反應體系中各組分最佳濃度進行引物篩選，篩選得到的引物隨機選取2條，對15個品種進行體系穩定性鑒定，結果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴增出條帶清晰、多態性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應體系是穩定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴增反應。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應體系為20 μL反應體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補充至20 μL。

3討論與結論

有關ISSR-PCR反應體系優化的報道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴增結果影響很大。本研究采用單因素試驗，對影響ISSR-PCR的各個反應因子進行單獨的梯度試驗，找出最佳反應條件。結果表明ISSR-PCR 反應受反應組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時各組分均有一個相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復性高等優點，但不同反應體系產生的結果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗條件下研究結果都有差異[10]。張紅心等對16個紅掌種質資源進行ISSR遺傳多樣性研究時采用的是25 μL ISSR反應體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗優化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個品種進行ISSR擴增分析，每個品種均能擴增出清晰條帶，并且多態性均達100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應體系穩定、可靠，同時也說明ISSR分子標記適合對安祖花進行遺傳多樣性分析。

本試驗建立的體系是采用單因素梯度試驗來進行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩定的條帶，這一優化的反應體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進一步利用ISSR分子標記技術對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構建及分子標記輔助育種等分子生物學研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標記與應用[M]. 北京：化學工業出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發棣，趙宏波，等. 應用ISSR對25個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關系的ISSR分析[J]. 中國農業科學，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗[J]. 江蘇農業科學，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應體系的優化[J]. 安徽農學通報，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應體系的建立[J]. 西北農業學報，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學會.中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術年會論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗檢測哺乳動物細胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：41-43.

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優化

2.2.1DNA模板量對PCR反應的影響試驗設置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時擴增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時擴增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復比較試驗，在2.0 ng/μL的模板用量時最穩定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時，擴增條帶比較弱，且條帶數少；當Taq酶用量為0.75～1.50 U時，均能擴增出明顯條帶。試驗中Taq 酶用量為1.0 U時擴增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時最適合該PCR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應的影響試驗中引物濃度的變化對產物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時雖然能擴增出產物，但是條帶數少且有些擴增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時均能擴增出清晰的條帶。經重復比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時反應穩定，條帶清晰且經濟，確定安祖花ISSR-PCR反應最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應的影響由可見，當Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴增條帶數增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時擴增產物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應的影響當dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時未擴增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時條帶缺失現象嚴重，且多數條帶模糊不清；當dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時擴增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時條帶最清晰穩定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應體系的穩定性鑒定及確立

根據各影響因子試驗結果，以反應體系中各組分最佳濃度進行引物篩選，篩選得到的引物隨機選取2條，對15個品種進行體系穩定性鑒定，結果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴增出條帶清晰、多態性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應體系是穩定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴增反應。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應體系為20 μL反應體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補充至20 μL。

3討論與結論

有關ISSR-PCR反應體系優化的報道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴增結果影響很大。本研究采用單因素試驗，對影響ISSR-PCR的各個反應因子進行單獨的梯度試驗，找出最佳反應條件。結果表明ISSR-PCR 反應受反應組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時各組分均有一個相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復性高等優點，但不同反應體系產生的結果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗條件下研究結果都有差異[10]。張紅心等對16個紅掌種質資源進行ISSR遺傳多樣性研究時采用的是25 μL ISSR反應體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗優化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個品種進行ISSR擴增分析，每個品種均能擴增出清晰條帶，并且多態性均達100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應體系穩定、可靠，同時也說明ISSR分子標記適合對安祖花進行遺傳多樣性分析。

本試驗建立的體系是采用單因素梯度試驗來進行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩定的條帶，這一優化的反應體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進一步利用ISSR分子標記技術對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構建及分子標記輔助育種等分子生物學研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標記與應用[M]. 北京：化學工業出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發棣，趙宏波，等. 應用ISSR對25個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]. 中國農業科學，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關系的ISSR分析[J]. 中國農業科學，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗[J]. 江蘇農業科學，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應體系的優化[J]. 安徽農學通報，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應體系的建立[J]. 西北農業學報，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學會.中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術年會論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗檢測哺乳動物細胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：41-43.