2種蝴蝶蘭組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

宋微+潘靜霞+吳靜

摘要：以紅龍、皇帝2個(gè)品種的蝴蝶蘭花梗為材料，1/3MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，篩選花梗使用HgCl2消毒的最佳時(shí)間，增殖培養(yǎng)基的最佳激素、蔗糖濃度，以確立最佳培養(yǎng)配方。結(jié)果表明，紅龍、皇帝品種最佳的誘導(dǎo)材料為開(kāi)過(guò)花的花梗；紅龍品種的最佳消毒時(shí)間為20 min，皇帝品種的最佳消毒時(shí)間為18 min；適合紅龍品種生長(zhǎng)的最佳激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖濃度為25 g/L；適合皇帝品種生長(zhǎng)的最佳激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖濃度為20 g/L。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；組織培養(yǎng)；消毒時(shí)間；激素

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0055-02

收稿日期：2013-09-02

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK2011498、BK2010345）；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院課題。

作者簡(jiǎn)介：宋微（1978—），女，黑龍江大慶人，博士，副教授，從事植物組織培養(yǎng)、微生物和植物病理學(xué)研究。E-mail：13360790@qq.com。蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）系蘭科蝴蝶蘭屬植物，花大而美麗，花期長(zhǎng)，品種多，栽培廣泛，深受人們喜愛(ài)，在花卉市場(chǎng)上常常供不應(yīng)求。在自然條件下，蝴蝶蘭主要靠分株、種子繁殖，繁殖率低，而且由于長(zhǎng)期進(jìn)行有性繁殖，帶病毒株增多，逐漸使種性降低，影響生長(zhǎng)。如今組織培養(yǎng)已經(jīng)成為蝴蝶蘭無(wú)性繁殖最常用的方法，既可以保持母本的優(yōu)良性狀，快速繁殖子代，又可以反季節(jié)栽培適應(yīng)市場(chǎng)需求[1-4]。以花梗芽作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)是代替蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的一種方法[1]，在不影響蝴蝶蘭母株的優(yōu)良性狀和經(jīng)濟(jì)條件下選取外植體，提高花梗芽的誘導(dǎo)率，避免病毒擴(kuò)散和危害，保持母株優(yōu)良的生物學(xué)特性[2]。本研究以花梗芽為外植體，篩選最佳快繁培養(yǎng)基，研究紅龍（Phalaenopsis amabilis “Red Dragon”）、皇帝（Phalaenopsis amabilis “Emperor”）2個(gè)品種的最佳培養(yǎng)方案，為這2個(gè)品種的快速繁育提供必要的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

分別取蝴蝶蘭紅龍、皇帝2個(gè)品種開(kāi)過(guò)花的花梗，除基部外至頂端第6節(jié)至第7節(jié)剝開(kāi)可見(jiàn)到芽的部位為組織培養(yǎng)的外植體材料，每個(gè)樣本100個(gè)，重復(fù)3次。

1.2方法

1.2.1清洗與消毒從溫室里取出材料后用流水沖洗1 h，加入3%的洗衣粉，取生長(zhǎng)時(shí)間超過(guò)40 d的花梗，提前把苞葉剝?nèi)ズ笥糜诮臃N[5-7]。以75%乙醇棉球擦拭花梗表面，放在無(wú)菌操作臺(tái)上備用，以節(jié)為單位切成段，每節(jié)段上端留2 cm，下端留3 cm。以解剖刀除去花梗節(jié)芽上的苞葉，去除節(jié)段表面病斑、焦枯部分[2]。以75%乙醇棉球重復(fù)擦拭去苞葉的花梗芽，力度適中，防止傷芽。以75%乙醇振蕩浸泡30 s，而后以0.1% HgCl2消毒，消毒時(shí)間分別采用8、10、12、14、16、18、20 min，再以無(wú)菌水振蕩沖洗3次，用解剖刀切去消毒后花梗兩端各0.5 cm，以芽自然生長(zhǎng)方向正向插入培養(yǎng)基內(nèi)[8]。

1.2.2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+20g/L蔗糖；增殖培養(yǎng)基為1/3MS+7 g/L瓊脂+1、2、3、4、5 mg/L 6-BA+0.1、0.2、03、0.4、0.5 mg/L NAA+5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖，pH值為6.8。組培瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基為100 mL/瓶，分裝后于121 ℃下滅菌21 min，備用。恒溫26 ℃培養(yǎng)，光照時(shí)間為10～12 h/d，光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2個(gè)品種蝴蝶蘭以0.1%HgCl2消毒8 min的外植體污染率均最高，分別為76.7%、93.3%。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體污染率降低，當(dāng)消毒時(shí)間延長(zhǎng)至20 min時(shí)，紅龍污染率為16.6%，皇帝污染率為16.7%，但芽同時(shí)出現(xiàn)毒死現(xiàn)象，芽死亡率為6.7%，致使萌芽率降低，所以不同品種的消毒時(shí)間存在著差異。由此可見(jiàn)，紅龍的最佳消毒時(shí)間為20 min，皇帝的最佳消毒時(shí)間為18 min，此消毒時(shí)間根據(jù)花梗芽的飽滿(mǎn)成熟度有所不同。

表1不同消毒時(shí)間對(duì)紅龍和皇帝2個(gè)品種萌發(fā)的影響

滅菌時(shí)間

（min）污染率（%）死亡率（%）萌發(fā)率（%）紅龍皇帝紅龍皇帝 紅龍皇帝876.693.30010.0 3.3 1073.383.30020.010.0 1263.380.00043.316.6 1450.056.60040.0 40.01643.346.60050.056.6 1826.620.00070.083.3 2016.616.70 6.7 86.6 66.6 注：培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+20 g/L 蔗糖。

2.2不同濃度的外源激素對(duì)花梗誘導(dǎo)和叢生芽產(chǎn)生的影響

經(jīng)過(guò)40 d培養(yǎng)后，由表2可知，當(dāng)激素組合為1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA時(shí)，紅龍、皇帝平均芽長(zhǎng)為1.56、1.92 cm，且其平均芽長(zhǎng)隨著6-BA、NAA濃度的增加而變長(zhǎng)。當(dāng)激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA時(shí)，紅花、皇帝叢生芽的平均長(zhǎng)度達(dá)到最長(zhǎng)，為3.04、2.67 cm。說(shuō)明紅龍和皇帝組培的最佳激素組合均為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

不同激素組合對(duì)2個(gè)品種叢生芽誘導(dǎo)的影響

激素濃度（mg/L）誘導(dǎo)率（%）平均芽長(zhǎng)（cm）6-BANAA紅龍皇帝紅龍皇帝10.120.0a95.6a1.56a1.92a20.240.0b96.6a1.65a1.98a30.360.0b97.2a2.41b2.49b40.470.0c97.2a2.42b2.58b50.576.6d100.0b3.04c2.67c注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3不同蔗糖濃度對(duì)芽長(zhǎng)和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對(duì)叢生芽的產(chǎn)生和芽長(zhǎng)有很大的差異[9]。本試驗(yàn)對(duì)紅龍和皇帝2個(gè)品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，紅龍品種的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為3.0 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為1.3個(gè)。當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，皇帝的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為2.9 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為2.3個(gè)。說(shuō)明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結(jié)論

許多研究結(jié)果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長(zhǎng)激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關(guān)鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會(huì)直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進(jìn)行不同時(shí)間的消毒，否則會(huì)提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時(shí)間為20 min，皇帝最佳的消毒時(shí)間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉翠蘭，王小芳，李雙云，等. 蝴蝶蘭花梗芽的組織培養(yǎng)[J]. 山東林業(yè)科技，2004（4）：37.

[2]張偉，曾伏虎，張?zhí)K鋒. 蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，17（3）：335-337.

[3]林漢銳，鐘融融，洪生標(biāo)，等. 蝴蝶蘭新品種滿(mǎn)天紅的特征特性及栽培技術(shù)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（2）：11-12.

[4]胡松華. 蝴蝶蘭[M]. 廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

[5]潘學(xué)峰，王安石，李海珠. 蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 熱帶林業(yè)，2005，33（1）：45-47.

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[7]李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，柯麗婉，等. 蝴蝶蘭根段的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：37.

[8]魯雪華，郭文杰，徐立暉，等. 蝴蝶蘭花梗節(jié)間段培養(yǎng)繁殖的初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29（5）：491-492.

[9]王蒂. 植物組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]

2.3不同蔗糖濃度對(duì)芽長(zhǎng)和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對(duì)叢生芽的產(chǎn)生和芽長(zhǎng)有很大的差異[9]。本試驗(yàn)對(duì)紅龍和皇帝2個(gè)品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，紅龍品種的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為3.0 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為1.3個(gè)。當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，皇帝的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為2.9 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為2.3個(gè)。說(shuō)明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結(jié)論

許多研究結(jié)果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長(zhǎng)激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關(guān)鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會(huì)直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進(jìn)行不同時(shí)間的消毒，否則會(huì)提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時(shí)間為20 min，皇帝最佳的消毒時(shí)間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

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[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]

2.3不同蔗糖濃度對(duì)芽長(zhǎng)和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對(duì)叢生芽的產(chǎn)生和芽長(zhǎng)有很大的差異[9]。本試驗(yàn)對(duì)紅龍和皇帝2個(gè)品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，紅龍品種的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為3.0 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為1.3個(gè)。當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，皇帝的平均芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，為2.9 cm，叢生芽平均個(gè)數(shù)為2.3個(gè)。說(shuō)明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)誘導(dǎo)率

（%）平均芽長(zhǎng)

（cm）叢生芽

平均個(gè)數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結(jié)論

許多研究結(jié)果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長(zhǎng)激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關(guān)鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會(huì)直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進(jìn)行不同時(shí)間的消毒，否則會(huì)提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時(shí)間為20 min，皇帝最佳的消毒時(shí)間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

參考文獻(xiàn)：

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[3]林漢銳，鐘融融，洪生標(biāo)，等. 蝴蝶蘭新品種滿(mǎn)天紅的特征特性及栽培技術(shù)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（2）：11-12.

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[5]潘學(xué)峰，王安石，李海珠. 蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 熱帶林業(yè)，2005，33（1）：45-47.

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[7]李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，柯麗婉，等. 蝴蝶蘭根段的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：37.

[8]魯雪華，郭文杰，徐立暉，等. 蝴蝶蘭花梗節(jié)間段培養(yǎng)繁殖的初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29（5）：491-492.

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[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]