淮山組織培養抑制褐變的研究

潘梅+王景飛+黃賽+呂德任+戚華莎+符瑞侃

摘要：以淮山品種桂淮5號為供試材料，研究不同外植體、培養條件、培養基質以及抗褐化劑等對淮山褐變的影響。結果表明，莖段外植體的褐變程度較輕，薯塊外植體的褐變程度嚴重；溫度和光照對褐變均有影響；液體培養的褐變程度較固體培養輕；在培養基中添加1.0 g/L活性炭，能夠有效抑制外植體的褐化，使褐化率降為70.37%，培養物能正常生長發育。

關鍵詞：淮山；組織培養；褐變；外植體；抗褐化劑

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0057-03

收稿日期：2013-09-14

基金項目：海南省農業科技示范推廣項目（編號：瓊農計財[2012]48號）；海南省農業綜合開發項目（編號：瓊農辦[2012]825）。

作者簡介：潘梅（1962—），女，廣西隆安人，高級園藝師，主要從事植物組織培養與開發利用研究。E-mail：panmei200@sina.com。

通信作者：符瑞侃，園藝師，主要從事藥用植物資源開發與利用研究。E-mail：fu0898@163.com。淮山（Dioscorea opposita）為薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物，其塊根含有大量的蛋白質、淀粉、維生素和有益的微量元素，目前已成為重要的國際性藥食兼用作物和珍稀蔬菜，市場需求量極大。在生產上，淮山主要利用薯塊和零余子制種繁殖，病蟲害較多，而且種性較易退化，產量和品質難以保障。運用組織培養技術是繁育淮山良種最為有效的方法，不僅能夠解決淮山繁殖系數低及長期營養繁殖所造成的病毒病和品質退化等問題，也是實現淮山產業化生產的基礎。已有學者開展了淮山組織培養研究[1-10]，但在淮山組織培養中褐化現象特別嚴重，影響培養物的生長發育，增殖率低，甚至導致培養物死亡。褐化現象是影響淮山組織培養的一個關鍵因素，目前有關淮山組織培養快速繁殖中的褐化問題研究很少[11]。因此，本研究探討了淮山外植體類型、培養條件、培養基質以及抗褐化劑類型等對淮山組織培養過程中外植體褐化的影響，以期為淮山組織培養快速繁殖提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為淮山品種桂淮5號的薯塊及薯塊催生的幼嫩莖段。

1.2試驗方法

1.2.1外植體預處理切取薯塊和帶節莖段，在洗衣粉液中浸泡10 min后用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇表面消毒30 s，以無菌水沖冼2次后用0.1% HgCl2浸泡薯塊25 min、莖段8 min，最后用無菌水沖洗5次，薯塊切成約1 cm見方的小塊，莖段切成長約2 cm的帶節小段，接種到培養基中。

1.2.2培養基以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 g/L NAA作為基礎培養基，所有培養基均含有30 g/L食用白糖，固體培養基添加6 g/L卡拉膠，pH值5.8。分裝好的培養基均經121 ℃、0.14 MPa高溫高壓滅菌20 min。

1.2.3試驗設計（1）以薯塊和莖段2種類型的外植體進行接種試驗，研究不同外植體類型的褐化反應；（2）設置22、25、28、32 ℃ 4種溫度，研究不同溫度對外植體褐化的影響；（3）設置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx 6種光照強度，研究不同光照強度對外植體褐化的影響；（4）培養基中添加 200 mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、300 mg/L聚乙烯吡咯烷酮、200 mg/L半胱氨酸、200 mg/L抗壞血酸、1.0 g/L活性炭，研究不同抗褐化劑對外植體褐化的影響；（5）設置添加6 g/L卡拉膠的固體培養基和未加卡拉膠的液體培養基（搖床轉速為100 r/min）進行外植體接種，觀察培養過程中的褐化情況，研究不同培養基質對外植體褐化的影響。

試驗項（1）～（4）采用10 cm×10 cm的聚丙烯透明薄膜袋作為培養容器，試驗項（5）以直徑6 cm、高9 cm的玻璃瓶為培養容器，所有處理均接種60袋（瓶），每袋（瓶）1個外植體，分別在接種后的10、20、30 d觀察外植體的褐化情況和生長情況，所有數據均為培養30 d的結果。

1.2.4培養條件無特別說明，培養溫度均為25 ℃，光照強度為1 500 lx，光照時間為8 h/d。

1.2.5統計方法依據培養袋中培養基的褐化直徑將褐化程度分為4個等級：（1）無褐化。培養基中未出現褐色。（2）輕度褐化。培養基褐色直徑<2 cm。（3）中度褐化。培養基褐色直徑2～5 cm。（4）重度褐化。培養基褐色直徑>5 cm，外植體枯死（圖1-A ）。

褐化率=褐化外植體數/（接種外植體總數-被污染的外植體數）×100%；各級褐化率=各級褐化數/（接種外植體總數-被污染的外植體數）×100%；中度及以上褐化率=中度褐化率+重度褐化率。

2結果與分析

2.1淮山不同外植體的褐化反應

2種外植體接種后3 d后均開始出現褐化現象，培養30 d所有外植體基部培養基均出現不同程度的褐化。由表1可知，2種外植體褐化程度不同，莖段外植體的褐化程度相對較

褐化率（%）莖段07.8429.4162.7592.16薯塊02.046.1291.8497.96

輕，輕度和中度褐化率合計為37.25%，重度褐化率為6275%；而薯塊外植體的褐化現象嚴重，培養基大面積出現黑褐色，輕度、中度褐化率合計僅占8.16%，而重度褐化率高達91.84%，比莖段外植體高出29.09百分點。這可能是因為薯塊本身所含酚類物質較多，加之接種前切成塊狀，損傷面較大，損傷面細胞中的酚類物質與氧氣聚合發生氧化反應，形成較多的有毒醌類物質擴散到培養基中[11]。

可以看出，隨著培養溫度升高，外植體褐化率加大，當溫度達到28 ℃時，外植體全部出現褐化現象；褐化程度也隨著溫度升高而加重，表現為輕度褐化的比例逐漸減少，重度褐化的比例逐漸加大。當溫度為22 ℃時，中度及以上褐化率最低，為80.70%，25、28 ℃時分別為89.09%、94.44%，而當溫度達到32 ℃時，中度及以上褐化率最高，達到96.23%，可見溫度對淮山褐化的影響較大。因為淮山的生長要求溫暖氣候，25～28 ℃為其最適宜溫度范圍[10]，所以培養室溫度不宜過低。根據試驗結果及淮山生長適宜溫度要求，淮山組織培養的溫度以25 ℃為宜。

不同培養溫度對外植體褐化的影響

培養溫度

（℃）無褐化率

（%）輕度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）223.51 15.7928.0752.6380.70251.829.0918.1870.9189.092805.5622.2272.2294.443203.7716.9879.2596.23

2.3不同光照強度對外植體褐化的影響

由表3可見，外植體的褐化隨著光照強度增強而加重，在0～1 000 lx光照強度下培養，少量外植體未出現褐化現象，褐化程度較輕，中度及以上褐化率為78.85%～88.89%；當光照強度在1 500、2 000 lx時，中度及以上褐化率相差不大，分別為92.85%、94.55%；當光照強度達到3 000 lx時，中度及以上褐化率達到100%。因此，綜合考慮外植體的褐化情況以及生長所需的光照，淮山組織培養光照強度以1 500～2 000 lx 為宜。

表3不同光照強度對外植體褐化的影響

光照強度

（lx）無褐化率

（%）輕度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）07.6913.4623.0855.7778.855005.5611.1016.6766.6783.341 0001.859.2618.5270.3788.891 50007.1523.2169.6492.852 00005.4523.6470.9194.553 0000024.5375.47100

2.4不同抗褐化劑對外植體褐化的影響

從表4可知，4種抗褐化劑均能不同程度地抑制外植體的褐化，中度及以上褐化率均低于對照處理。外植體在添加4種抗褐化劑的培養基中都能正常生長，月增殖倍數均大于對照處理。培養10～15 d，4種抗褐化劑的抑制效果較明顯，但隨著培養時間延長，各處理的褐化現象均越來越重，所有處理外植體基部培養基均有全部褐化的現象，只是數量不同。加入活性炭的處理對外植體褐化的抑制效果最好，外植體初始褐化時間為5 d，比其他4種抗褐化劑處理晚2 d，褐化率最低，為70.37%，而且褐化程度最輕，外植體基部培養基褐化直徑小于2 cm的占51.85%，重度褐化率僅為185%，中度及以上褐化率為18.52%。PVP處理對外植體褐化的抑制效果居于第二，且高濃度PVP優于低濃度PVP。半胱氨酸和抗壞血酸2種處理對外植體褐化的抑制效果較差，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%。因此，在培養基中添加活性炭對外植體褐化的抑制起到了良好的作用。

2.5不同培養基質對外植體褐化的影響

本試驗中外植體褐化現象在2種基質中的

不同抗褐化劑對外植體褐化的影響

抗褐化劑無褐化

率（%）輕度褐

化率（%）中度褐

化率（%）重度褐

化率（%）中度及以上

褐化率（%）200 mg/L PVP3.7012.9627.7855.5683.34300 mg/L PVP5.3623.2130.3641.0771.43200 mg/L半胱氨酸5.088.4717.069.4586.45200 mg/L抗壞血酸1.827.2721.8169.1090.911 g/L活性炭29.6351.8516.671.8518.52對照06.6727.5065.8393.33

表現差別較大，固體培養基中褐化程度明顯大于液體培養基，其初始褐化時間早，出現枯死株，抽生芽生長狀況差。固體培養基中培養3 d開始出現褐化，培養10 d時，所有外植體基部的固體培養基均出現褐化現象，以外植體基部為中心，培養基褐化直徑1～2 cm的占75.93%，3～4 cm的占24.07%；培養時間延至30 d時，72.22%的外植體基部培養基褐化直徑達到了5 cm左右，組培苗莖節數少且較為細弱。液體培養方式培養8 d時培養液開始出現褐色，10 d后培養液變為淺褐色，培養時間達到30 d后，培養液變為深褐色，但外植體生長狀況良好，分化芽苗多而粗壯，最多達到12芽，平均增殖倍數為5.11，比固體培養方式高2.24。可能是因為外植體溢出的有毒物質在液體中可以很快擴散而被稀釋，短時間內無法形成一個有效作用濃度點，因而對外植體造成的傷害較輕。因此，液體培養方式比固體培養方式更適宜淮山的快速繁殖。

不同培養基質對外植體褐化的影響

培養基質初始褐化

時間（d）枯化株數

（株）增殖倍數生長狀況固體培養基322.87較細弱液體培養基805.11粗壯

3結論與討論

3.1不同外植體的褐化程度不同

本試驗結果表明，莖段外植體的褐化程度較薯塊外植體輕，該結果與蔡建榮的研究結果[11]一致。淮山的組織培養以莖段作為外植體較適宜。

3.2溫度、光照對褐化均有影響

本試驗中，隨著培養溫度升高和光照強度加強，外植體的褐化程度加重，溫度為25 ℃，光照強度為1 500～2 000 lx時，外植體褐化較輕并能正常生長。淮山外植體低溫和暗處理的褐化率最低，褐化程度最小，因為酚類化合物合成和氧化過程中有許多酶系統參與，而酶系統的活性受溫度和光照影響。高溫和光照會提高酶的活性，促進培養組織中酚類物質氧化，加速外植體褐化，因此在低溫、黑暗或遮光條件下培養外植體可以降低多酚氧化酶的活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。外植體的生長發育需要適宜的溫度和光照，應以能降低外植體褐化而又不影響其正常生長的范圍為宜。

3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結果表明，培養基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關。活性炭和PVP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質從外植體周圍吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上還降低了光照強度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結果與蔡建榮的研究結果有所不同，蔡建榮認為PVP抑制褐化的效果優于活性碳[11]，該結果的差異可能與試驗材料不同有關。

3.4液體基質較固體基質褐化輕

本試驗結果表明，淮山組織培養的最適培養基質為不加卡拉膠的液體培養基，能有效預防褐化，提高成活率，培養物生長快且繁殖系數大，但由于液體培養需要特別的設備，并不適宜進行大規模的培養，只適宜前期的誘導培養和初始培養材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應以固體培養基質為主。

3.5淮山的褐化現象難以完全抑制

本研究結果表明，在淮山的組織培養過程中，培養物的褐化現象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養基中添加抗褐化劑以及調控培養條件能更有效地降低培養物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養物能正常生長發育。

參考文獻：

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[12]程廣有. 名優花卉組織培養技術[M]

3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結果表明，培養基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關。活性炭和PVP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質從外植體周圍吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上還降低了光照強度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結果與蔡建榮的研究結果有所不同，蔡建榮認為PVP抑制褐化的效果優于活性碳[11]，該結果的差異可能與試驗材料不同有關。

3.4液體基質較固體基質褐化輕

本試驗結果表明，淮山組織培養的最適培養基質為不加卡拉膠的液體培養基，能有效預防褐化，提高成活率，培養物生長快且繁殖系數大，但由于液體培養需要特別的設備，并不適宜進行大規模的培養，只適宜前期的誘導培養和初始培養材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應以固體培養基質為主。

3.5淮山的褐化現象難以完全抑制

本研究結果表明，在淮山的組織培養過程中，培養物的褐化現象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養基中添加抗褐化劑以及調控培養條件能更有效地降低培養物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養物能正常生長發育。

參考文獻：

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[12]程廣有. 名優花卉組織培養技術[M]

3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結果表明，培養基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關。活性炭和PVP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質從外植體周圍吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上還降低了光照強度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結果與蔡建榮的研究結果有所不同，蔡建榮認為PVP抑制褐化的效果優于活性碳[11]，該結果的差異可能與試驗材料不同有關。

3.4液體基質較固體基質褐化輕

本試驗結果表明，淮山組織培養的最適培養基質為不加卡拉膠的液體培養基，能有效預防褐化，提高成活率，培養物生長快且繁殖系數大，但由于液體培養需要特別的設備，并不適宜進行大規模的培養，只適宜前期的誘導培養和初始培養材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應以固體培養基質為主。

3.5淮山的褐化現象難以完全抑制

本研究結果表明，在淮山的組織培養過程中，培養物的褐化現象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養基中添加抗褐化劑以及調控培養條件能更有效地降低培養物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養物能正常生長發育。

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