拮抗放線菌06—6的篩選鑒定及其發酵條件優化

郝永麗+宗兆鋒+高博+胡海波+曲寶茹

摘要：從采集的土樣中分離出拮抗放線菌，并篩選出對4種靶標菌均具有明顯拮抗效果的菌株06-6，對該菌株進行發酵條件優化及生理生化鑒定，從而確定該菌株的最佳發酵技術參數，通過鑒定初步將其歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。

關鍵詞：拮抗放線菌；篩選；鑒定；發酵條件；優化

中圖分類號： Q939.92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0107-03

收稿日期：2013-09-25

基金項目：教育部創新團隊發展計劃（編號：200558）；國家高等學校學科創新引智計劃（編號：B07049）。

作者簡介：郝永麗（1981—），女，內蒙古赤峰人，碩士，助理研究員，從事園藝植物病蟲害防治研究。E-mail：yonglihao1981@163.com。拮抗菌作為一種具有豐富資源的微生物類群，其產生的抗生素及其他次生代謝物質在農作物病蟲害生物防治方面具有重要作用，是具有使用價值和經濟價值的一類微生物，在植物病蟲害生物防治中應用前景廣[1-4]。利用拮抗放線菌產生的活性物質進行真菌病害防治，具有周期短、易于研究、便于生產、無毒害等優點。本研究旨在從采集的土樣中分離篩選殺菌力強、抗菌譜廣的拮抗放線菌；并對其發酵條件和分類進行研究，為優勢拮抗放線菌在生物防治中的應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣來源試驗用土壤標本分別采集于陜西商洛、周至、乾縣、戶縣及山東諸城。

1.1.2供試病原菌供試靶標菌由西北農林科技大學微生物實驗室提供，包括番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）和粉紅聚端孢（Trichothecium roseum）。

1.2篩選方法

1.2.1菌株的分離與純化采集的土壤過篩，研磨后稱取 0.1 g 樣品，制備成不同濃度的稀釋液[5]。用移液器吸取特定稀釋濃度的液體20 μL，滴在高氏培養基表面，涂勻。將皿倒置于28 ℃培養箱中培養，幾天后從皿內分離出單菌落，用顯微鏡檢純化，保存于G氏斜面中。

1.2.2拮抗放線菌的篩選用打孔器將培養好的放線菌菌苔打成直徑5 mm的菌餅置于PDA平板中間，3 d后將同樣大小的4種供試病原真菌菌餅對峙接于兩側，21 ℃下培養，觀察并測量抑菌圈的大小。將初篩得到的菌株于SNB培養液中振動培養，發酵液離心后取上清液，采用微孔擴散法測定發酵液及發酵濾液的抑菌活性，供試靶標菌為西瓜枯萎菌。

1.3拮抗菌的形態和生理生化鑒定

將待鑒定的菌株作插片培養，觀察記載其生長情況、基內菌絲、氣生菌絲、孢子絲的顏色、形態及是否產生可溶性色素[6]。菌株生理生化鑒定參照文獻[7]，包括淀粉水解、H2S產生、黑色素產生、碳源利用、纖維素水解、牛奶凝固和液化等[8]。

1.4拮抗菌株發酵條件優化

1.4.1培養基的篩選將菌株06-6分別接種于13種液體發酵培養基（具體成分見表1）中，28 ℃下搖床培養6 d，將發酵液離心，取其上清液備用。選擇西瓜枯萎菌為靶標菌，在準備好的PDA平板上均勻涂好靶標菌。將3張9 mm2大小的濾紙片均勻鋪于PDA平板上，每張小紙片滴入10 μL的發酵上清液。3 d后測量數據，用抑菌圈直徑表示不同培養基培養條件下的菌株06-6對病原菌拮抗作用的強弱。1.4.2最適裝液量pH值自然，分別在250 mL三角瓶中加入DBY液體培養基25、50、75、100、125、150 mL。滅菌后接種菌株06-6，置搖床發酵培養6 d后，將各發酵上清液分別加入到準備好的PDA平板中央[9]。5 d后測量抑菌作用。

1.4.3最佳發酵時間pH值自然，250 mL三角瓶中接種 06-6 菌懸液，置搖床培養，分別于4、5、6、7、8、9 d時測量抑菌作用，確定最宜發酵時間。

1.4.4發酵初始pH值利用選擇好的瓶裝量和培養時間，將初始pH值分別調至6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。測量抑菌作用。

2結果與分析

2.1拮抗菌株的分離和篩選

利用稀釋分離法，從采集的土樣中分離放線菌。結果表明，在分離出的放線菌中對4種病原真菌有很強抑制作用的菌株有4株，其中菌株06-6無論在皿內拮抗試驗還是在發酵液抑菌作用測定方面都表現出極強的抑菌效果。

2.2拮抗菌06-6的形態和生理生化特征

2.2.1形態特征菌株06-6在高氏一號培養基中，氣生菌絲直，呈灰色；基內菌絲培養初期為白色，到孢子成熟以后轉

表2菌株06-6的代謝產物對病原菌的抑制作用

處理抑菌圈直徑（cm）灰葡萄孢西瓜枯萎菌粉紅聚端孢蘋果炭疽菌菌餅29.510.0 29.5 27.0 發酵液22.3 21.7 24.5 19.8

為橙黃色；孢子橢圓形，表面光滑，串生；孢子絲不結球。

2.2.2菌株06-6的生理生化特性菌株06-6可使牛奶鈍化，明膠不液化，淀粉水解；纖維素中能生長，但是不利用；不產生硫化氫。該菌可利用蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、肌糖、山梨糖、半乳糖、阿拉伯糖；不能利用木糖。

2.3拮抗菌發酵條件優化

2.3.1不同培養基對菌株抑菌活性的影響從圖1可以看出，菌株06-6在DBY、SNB、aSNB培養基中的發酵液抑菌率較高，其中對西瓜枯萎菌抑制效果最好是在DBY中培養的菌株發酵液，抑菌圈直徑達 23 mm。確定DBY為最佳培養基，配方為葡萄糖4.0 g、大豆粉0.5 g、酵母粉0.5 g、硫酸銨 0.5 g、NaCl 0.1 g、K2HPO4 0005 g。

2.3.2幾個發酵參數對發酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發酵參數，即發酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養時間 6 d、搖床轉速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優秀菌株06-6。皿內檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內對多數菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發酵參數研究

放線菌的發酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養基成分影響外，還受培養時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產菌種的最佳發酵技術參數，設計合理的發酵工藝，使生產菌種處于最佳發酵條件下，為其進行發酵罐培養和生物農藥的開發提供理論依據。

2.3菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據的結合，而不再是單純地形態分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統的經典分類、數值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

參考文獻：

[1]徐劍宏，王建偉，胡曉丹，等. 小麥赤霉病菌拮抗菌AF0907的分離鑒定及其拮抗特性[J]. 江蘇農業學報，2013，29（3）：517-522.

[2]劉永鋒，陸凡，陳志誼，等. 拮抗細菌T429和T392的生物活性及其對水稻白葉枯病的防治效果[J]. 江蘇農業學報，2012，28（4）：733-737.

[3]周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1986.

[4]郭風柳，張海穎，李勇，等. 馬鈴薯瘡痂病拮抗菌株B1的鑒定及防效測定[J]. 江蘇農業科學，2013，41（5）：90-93.

[5]安德榮，慕小倩，劉翠娟，等. 土壤拮抗放線菌的分離和篩選[J]. 微生物學雜志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 農用抗生素和抗生菌的篩選[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，1975：11-12.

[8]徐長倫，董平，吾提庫爾·馬合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素產生菌的鑒定[J]. 微生物學通報，1994，21（6）：350-352.

[9]莊敬華，高增貴，劉限，等. 不同發酵條件對木霉產孢類型的影響[J]. 中國生物防治，2005（1）：37-40.

[10]劉翠娟，段琦梅，安德榮. 抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發酵條件的優化[J]. 微生物學雜志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2幾個發酵參數對發酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發酵參數，即發酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養時間 6 d、搖床轉速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優秀菌株06-6。皿內檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內對多數菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發酵參數研究

放線菌的發酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養基成分影響外，還受培養時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產菌種的最佳發酵技術參數，設計合理的發酵工藝，使生產菌種處于最佳發酵條件下，為其進行發酵罐培養和生物農藥的開發提供理論依據。

2.3菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據的結合，而不再是單純地形態分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統的經典分類、數值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

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[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2幾個發酵參數對發酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發酵參數，即發酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養時間 6 d、搖床轉速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優秀菌株06-6。皿內檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內對多數菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發酵參數研究

放線菌的發酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養基成分影響外，還受培養時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產菌種的最佳發酵技術參數，設計合理的發酵工藝，使生產菌種處于最佳發酵條件下，為其進行發酵罐培養和生物農藥的開發提供理論依據。

2.3菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據的結合，而不再是單純地形態分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統的經典分類、數值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

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[9]莊敬華，高增貴，劉限，等. 不同發酵條件對木霉產孢類型的影響[J]. 中國生物防治，2005（1）：37-40.

[10]劉翠娟，段琦梅，安德榮. 抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發酵條件的優化[J]. 微生物學雜志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.