鵝新型坦布蘇病毒囊膜蛋白的二級結構與B細胞表位預測

韓凱凱+李銀+黃欣梅+等

摘要：以鵝坦布蘇病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）的囊膜蛋白基因序列為基礎，采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson法和Karplus-Schulz法預測蛋白質的二級結構，采用Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案預測鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白的B細胞表位。結果表明，鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白肽鏈的35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482區段為預測的B細胞表位優勢區。綜合研究結果，利用多參數方案綜合預測E蛋白的B細胞抗原表位為進一步鑒定表位及設計疫苗奠定了基礎。

關鍵詞：坦布蘇病毒；囊膜蛋白；二級結構；B細胞表位

中圖分類號： S858.335.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0166-03

收稿日期：2013-09-13

基金項目：國家自然科學基金（編號：31172345）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（12）5048]。

作者簡介：韓凱凱（1983—），男，河南新鄉人，博士，助理研究員，主要從事家禽病毒分子生物學研究。E-mail：hankk0917@126.com。

通信作者：李銀，博士，研究員，主要從事家禽疫病流行病學和防治相關的研究。E-mail：muziyin08@163.com。2010年春季以來，上海、浙江、江蘇等地相繼暴發了一種導致鴨鵝產蛋量急劇下降的新發疾病，發病鴨鵝主要表現為高熱、運動障礙、食欲下降甚至廢絕、產蛋下降甚至停止，死亡率可達 5%～10%[1]。其典型病理變化表現為鴨鵝的卵巢先發生出血、萎縮、破裂，患病后期出現神經癥狀，倒地震顫，最終衰竭死亡。該病傳播迅速、波及面廣，幾乎席卷了整個水禽養殖密集地區，給我國鴨鵝養殖業造成了巨大損失[2]。目前已證實，引起該病的病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）[3]。坦布蘇病毒屬于黃病毒科（Flaviviridae）不分節段的單股正鏈 RNA 病毒，含有單一的開放讀碼框，編碼 結 構 蛋 白（C、 PrM、E）和 非 結 構 蛋 白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），其中E蛋白是坦布蘇病毒的囊膜蛋白，由 500個氨基酸組成，在病毒的吸附、融合、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用[4]。測定E蛋白的晶體結構發現，它在空間上可以形成3個不同的結構域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區）。在乙型腦炎病毒E蛋白抗原表位研究中，Kolaskar等認為，E蛋白的三維結構域Ⅲ（292～402 aa）集中許多抗原中和表位[5]。Seif等通過分段表達E蛋白，證明了中和表位存在于 E373-399位的27個氨基酸序列內[6]。Wu等研究發現，JEV的中和位點主要集中在EⅢ的E307-309、E327-333、E386-390這3個區域內[7]。由于該病毒的發現時間不長，其主要蛋白抗原表位研究尚未見報道。有學者提出，蛋白質的二級結構、親水性、柔韌性、抗原性、表面可及性等特性與B細胞抗原的表位分布存在密切聯系[8]。本試驗首次應用生物信息技術對鵝坦布蘇病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）E蛋白基因推導的肽鏈進行蛋白質二級結構和B細胞表位的預測分析，旨在為坦布蘇病毒E蛋白功能的研究、抗體的制備及分子疫苗的設計等提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

預測所使用的坦布蘇病毒毒株來自鵝源JS804株，其病毒開放閱讀框氨基酸序列由筆者所在實驗室測定，共有500個氨基酸殘基，GeneBank登錄號為JF895923。

1.2試驗方法

先用單參數對毒株E蛋白的結構及性質進行預測，再采用不同的參數對E蛋白的二級結構及B細胞表位進行綜合預測和分析。

1.2.1GTMUV E蛋白二級結構預測應用DNAStar軟件的protean模塊進行二級結構預測。采用Chou-Fasman法從氨基酸殘基的晶體結構來預測蛋白質的二級結構；用Garnier-Robson法計算特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性；用Karplus-Schultz法預測蛋白質骨架區的柔韌性。其中各參數的意義見相關文獻[9-10]。

1.2.2GTMUV E蛋白B細胞抗原表位預測用DNA Star軟件Protean程序預測B細胞抗原表位；用Kyte-Doolittle方法，同時依據氨基酸組成預測蛋白的親水區和疏水區；用Emini方法預測特定區域于蛋白質表面的可及性；用Jameson-Wolf法預測蛋白的抗原指數，同時根據http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input網址中的Kolaskar-Tongaonkar法預測蛋白的平均抗原表位指數。結合蛋白的親水性、表面可及性、柔韌性、抗原指數等對測定結果進行綜合分析。綜合預測結果，預測鵝坦布蘇病毒E蛋白的潛在優勢B細胞抗原表位，其中各參數的意義參考相關文獻[11-13]。

2結果與分析

2.1GTMUV E蛋白的氨基酸序列

鵝坦布蘇病毒E蛋白基因編碼500個氨基酸，其理論分子量為54.38 kDa，理論等電點pI為7.32，存在跨膜區域。通過http：//prosite.expasy.org/scanprosite/在線服務器預測表明，該蛋白有N_糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點和N-豆蔻酰化位點。

2.2GTMUV E蛋白二級結構的預測

采用DNAStar軟件的Chou-Fasman法、Garnier-Robson法以及Karplus-Schultz法對E蛋白的二級結構進行預測，結果見圖1。

Garnier-Robson法預測結果顯示，E蛋白有14個α-螺旋，32個β-折疊區域。Chou-Fasman法預測結果顯示，E蛋白有16個α-螺旋，23個β-折疊區域。2種方法預測出的α-螺旋均較β-折疊數量少；2種方法預測的α-螺旋共有12個，分別位于41～57、79～81、87～92、117～120、133～144、157～165、179～181、239～252、261～267、285～296、412～417、468～478區段上；2種方法預測的β-折疊區域共有20個，分別位于1～4、20～25、31～36、62～38、166～170、186～189、201～205、270～274、299～302、310～314、322～328、338～341、254～359、381～386、391～397、423～425、435～438、443～448、482～486、491～496區段上。同時發現，Garnier-Robson法預測的β-轉角區域遠遠少于Chou-Fasman法，Gamier-Robson法預測的無規則卷曲分布區段相對集中，主要位于15～17、145～148、226～239、456～461區段上。

2.3柔韌性區域分析

利用Karplus-Schultz法預測E蛋白骨架區的柔韌性，由結果可知，E蛋白骨架區含有分布較均勻的柔韌性區域，肽鏈中具有較高表面可及性的區域主要在62～78、92～104、225～239、273～286、313～322、362～370和399～416區段上（圖2）。由于這些蛋白肽段的柔韌性較大，發生扭曲、折疊的概率較高，因此形成表位的可能性較大，容易與抗體進行嵌合。

2.4E蛋白的B細胞抗原表位預測分析

2.4.1E蛋白的親水性預測分析利用Kyte-Doolittle方法預測E蛋白的親水性，結果顯示，E蛋白具有較高的親水性，親水性區域的分布較均勻，主要分布在E蛋白肽鏈的36～45、60～104、119～137、147～165、174～199、207～251、275～309、310～320、391～405和475～483區段上（圖3）。B細胞抗原表位多位于蛋白外側，而親水氨基酸殘基多位于蛋白表面，因此該區段位于蛋白表面的可能性最大，作為抗原表位的概率也最高。

2.4.2E蛋白的表面可及性預測分析利用Emini方法進行E蛋白的表面可及性分析，結果表明，E蛋白肽鏈中具有較高表面可及性的區域在7～12、34～41、80～89、123～126、130～136、148～163、233～239、245～250、315～319、392～402和476～481區段上（圖4）。由于這些區域可能位于蛋白分子表面，因此有可能形成表位。

2.4.3E蛋白的抗原指數及抗原表位指數預測分析應用DNAStar軟件，采用Jameson-Wolf方法對E蛋白的抗原性進行預測。從圖5的分析可見，E蛋白存在有多個潛在的抗原表位位點，具有較高抗原指數的區域在6～19、26～31、33～44、61～89、92～105、108～115、118～137、144～159、172～177、179～186、189～199、226～251、257～262、273～301、312～322、330～339、344～355、376～383、388～395、397～418和475～484區段上。Kolaskar-Tongaonkar法預測的E蛋白平均抗原表位指數為1. 027，詳見圖6。

2.5E蛋白B細胞抗原表位綜合預測

通過對鵝坦布蘇病毒E蛋白的二級結構、親水性、柔韌性、抗原指數、表面可及性等參數分析顯示，若抗原表位指數≥1.027，親水性指數≥0，氨基酸的抗原表位可及性指數≥1，且區段內部或附近具有柔韌性結構，則這一區段為抗原表位的可能性較大。按照如上方法篩選表明，在E蛋白肽鏈的第35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482區段上，各種方案預測的結果基本一致，且在蛋白二級結構上含有較易形成抗原表位的轉角和無規則卷曲結構。因此可以推測，E蛋白的B細胞抗原表位可能在以上區域內或附近。

3結論與討論

B細胞識別蛋白抗原時，是以其表面的B細胞抗原受體（BCR）與蛋白抗原表位結合，此過程與抗原抗體的結合類似。作為B細胞的抗原表位，應位于或易于移動到蛋白抗原表面，有利于與B細胞抗原受體或抗體結合；同時還要有一定柔韌性，因為抗原與抗原受體或抗體的結合是一個相互嵌合的過程。因此，預測B細胞抗原表位時主要從蛋白質的二級結構、柔韌性、表面可及性和親水性等幾個方面入手。蛋白質二級結構與表位分布關系密切，在蛋白質結構中作為骨架起穩定作用的主要是α-螺旋和β-折疊，而決定蛋白質功能與抗原表位分布的則多是β-轉角和無規則卷曲[14]。

由于螺旋區段和折疊區段的化學鍵能較高，主要維持蛋白的高級結構，且經常位于蛋白質內部，很難較好地與抗體嵌合，不易形成抗原表位；而轉角區域和無規則卷曲區域的結構是比較松散的結構，易于發生扭曲、盤旋，并多位于蛋白質分子表面，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性較大。蛋白質的柔韌性是指蛋白抗原構象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定程度的活動性；親水性分析結合二級結構預測已被廣泛應用于抗原表位分析[15]。

本研究采用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法預測鵝坦布蘇病毒蛋白的二級結構，利用Karplus-Schulz法預測其柔性區域，利用Kyte-Doolittle方法預測E蛋白的親水區和疏水區。結果顯示，鵝坦布蘇病毒E蛋白的二級結構較為復雜，且α-螺旋和β-折疊分布相對均勻，含有較多的轉角和無規則卷曲等柔性區域，這些柔性區域的存在為抗原表位的確定提供了有力的證據。同時，與這些區域相對應的親水性、柔韌性、抗原指數和表面可及性等參數也較高，因此預測這些區段應是潛在優勢B細胞抗原表位所在區段。需要注意的是，一個蛋白質中某段氨基酸序列能否誘導體內產生抗體是多種復雜因素共同作用的結果。B細胞抗原表位，尤其是其構象表位，主要是通過三維立體結構來展現其抗原性，而生物信息學分析軟件主要是對其二級結構進行預測，因此用于預測構象依賴型表位有一定的局限性。本試驗的預測結果只能作為鑒定鵝坦布蘇病毒E蛋白潛在表位的參考，預測結果正確與否還有待于科學研究證實。即便如此，通過生物信息學的方法對E蛋白進行預測，不僅可以了解坦布蘇病毒E蛋白抗原的結構、功能、抗原抗體反應等有關免疫反應的諸多信息，而且對診斷試劑研發、藥物制備和核酸疫苗設計等也具有指導意義。

參考文獻：

[1]Yun T，Ye W C，Ni Z，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China[J]. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：311-319.

[2]Huang X M，Han K K，Zhao D M，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J]. Research in Veterinary Science，2013，94（3）：774-780.

[3]Yan P X，Zhao Y S，Zhang X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology，2011，417（1）：1-8.

[4]朱麗萍，顏世敢. 鴨坦布蘇病毒研究進展[J]. 中國預防獸醫學報，2012，34（1）：79-82.

[5]Kolaskar A S，Kulkarni-Kale U. Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J]. Virology，1999，261（1）：31-42.

[6]Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al. Finer mapping of neutralizing epitope（s） on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system[J]. Vaccine，1995，13（16）：1515-1521.

[7]Wu S C，Lin C W. Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope protein[J]. Virus Research，2001，76（1）：59-69.

[8]劉麗娜，潘渠，朱軍民，等. 2-型豬鏈球菌保護性抗原RfeA的B細胞表位預測[J]. 成都醫學院學報，2011，6（2）：133-135.

[9]Chou P Y，Fasman G D. Prediction of the secondary structure of protein comformation[M]. New York：Plenum Press，1990：549-586.

[10]Garnier J，Osguthorpe D J，Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of Molecular Biology，1978，120（1）：97-120.

[11]Kyte J，Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology，1982，157（1）：105-132.

[12]Emini E A，Hughes J V，Perlow D S，et al. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J]. Journal of Virology，1985，55（3）：836-839.

[13]Jameson B A，Wolf H. The antigenic index：a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J]. Computer Applications in the Biosciences，1988，4（1）：181-186.

[14]Doolittle R F. The roots of bioinformatics in protein evolution[J]. PLOS Computational Biology，2010，6（7）：e1000875.

[15]Wang H W，Lin Y C，Pai T W，et al. Prediction of B-cell linear epitopes with a combination of support vector machine classification and amino acid propensity identification[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology，2011，Article ID：432830，

參考文獻：

[1]Yun T，Ye W C，Ni Z，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China[J]. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：311-319.

[2]Huang X M，Han K K，Zhao D M，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J]. Research in Veterinary Science，2013，94（3）：774-780.

[3]Yan P X，Zhao Y S，Zhang X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology，2011，417（1）：1-8.

[4]朱麗萍，顏世敢. 鴨坦布蘇病毒研究進展[J]. 中國預防獸醫學報，2012，34（1）：79-82.

[5]Kolaskar A S，Kulkarni-Kale U. Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J]. Virology，1999，261（1）：31-42.

[6]Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al. Finer mapping of neutralizing epitope（s） on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system[J]. Vaccine，1995，13（16）：1515-1521.

[7]Wu S C，Lin C W. Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope protein[J]. Virus Research，2001，76（1）：59-69.

[8]劉麗娜，潘渠，朱軍民，等. 2-型豬鏈球菌保護性抗原RfeA的B細胞表位預測[J]. 成都醫學院學報，2011，6（2）：133-135.

[9]Chou P Y，Fasman G D. Prediction of the secondary structure of protein comformation[M]. New York：Plenum Press，1990：549-586.

[10]Garnier J，Osguthorpe D J，Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of Molecular Biology，1978，120（1）：97-120.

[11]Kyte J，Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology，1982，157（1）：105-132.

[12]Emini E A，Hughes J V，Perlow D S，et al. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J]. Journal of Virology，1985，55（3）：836-839.

[13]Jameson B A，Wolf H. The antigenic index：a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J]. Computer Applications in the Biosciences，1988，4（1）：181-186.

[14]Doolittle R F. The roots of bioinformatics in protein evolution[J]. PLOS Computational Biology，2010，6（7）：e1000875.

[15]Wang H W，Lin Y C，Pai T W，et al. Prediction of B-cell linear epitopes with a combination of support vector machine classification and amino acid propensity identification[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology，2011，Article ID：432830，

參考文獻：

[1]Yun T，Ye W C，Ni Z，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China[J]. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：311-319.

[2]Huang X M，Han K K，Zhao D M，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J]. Research in Veterinary Science，2013，94（3）：774-780.

[3]Yan P X，Zhao Y S，Zhang X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology，2011，417（1）：1-8.

[4]朱麗萍，顏世敢. 鴨坦布蘇病毒研究進展[J]. 中國預防獸醫學報，2012，34（1）：79-82.

[5]Kolaskar A S，Kulkarni-Kale U. Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J]. Virology，1999，261（1）：31-42.

[6]Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al. Finer mapping of neutralizing epitope（s） on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system[J]. Vaccine，1995，13（16）：1515-1521.

[7]Wu S C，Lin C W. Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope protein[J]. Virus Research，2001，76（1）：59-69.

[8]劉麗娜，潘渠，朱軍民，等. 2-型豬鏈球菌保護性抗原RfeA的B細胞表位預測[J]. 成都醫學院學報，2011，6（2）：133-135.

[9]Chou P Y，Fasman G D. Prediction of the secondary structure of protein comformation[M]. New York：Plenum Press，1990：549-586.

[10]Garnier J，Osguthorpe D J，Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of Molecular Biology，1978，120（1）：97-120.

[11]Kyte J，Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology，1982，157（1）：105-132.

[12]Emini E A，Hughes J V，Perlow D S，et al. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J]. Journal of Virology，1985，55（3）：836-839.

[13]Jameson B A，Wolf H. The antigenic index：a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J]. Computer Applications in the Biosciences，1988，4（1）：181-186.

[14]Doolittle R F. The roots of bioinformatics in protein evolution[J]. PLOS Computational Biology，2010，6（7）：e1000875.

[15]Wang H W，Lin Y C，Pai T W，et al. Prediction of B-cell linear epitopes with a combination of support vector machine classification and amino acid propensity identification[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology，2011，Article ID：432830，